茍?bào)w忠　賀仲兵　潘甚錫

摘要 [目的]探討一種富硒蛇莓的培育方法。[方法]采用亞硒酸鈉濃度0、2、4、8、16、32、64、128、256、512 ng/mL的水溶液對(duì)蛇莓葉噴施，考察噴施亞硒酸鈉后有機(jī)硒在蛇莓中的變化規(guī)律。[結(jié)果]葉面噴施硒能顯著提高蛇莓中的有機(jī)硒含量。蛇莓中有機(jī)硒的含量隨噴施亞硒酸鈉濃度的提高而增加，當(dāng)噴施亞硒酸鈉濃度達(dá)到256 ng/mL時(shí)，蛇莓中的有機(jī)硒含量達(dá)到最大值，其值為20.94 μg/g。[結(jié)論]蛇莓葉面噴施亞硒酸鈉溶液的最佳濃度為256 ng/mL，且采用低濃度的亞硒酸鈉溶液對(duì)蛇莓進(jìn)行多次噴硒的方法有利于蛇莓對(duì)無(wú)機(jī)硒的吸收和轉(zhuǎn)化。

關(guān)鍵詞 蛇莓；亞硒酸鈉；葉面噴施；硒

中圖分類號(hào) S567.23 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）17-0065-03

Abstract [Objective] To research a method of cultivating richselenium Duchesnea indica （Andr.） Focke. [Method]Sodium selenite was sprayed on the leaves of D. indica，the concentrations of which were 0， 2， 4， 8， 16， 32， 64， 128， 256， 512 ng/mL， respectively. The change law of organic selenium in D. indica after spraying sodium selenite was investigated. [Result] With the rise of spraying sodium selenite concentration， the content of organic selenium was significantly improved.When spraying sodium selenite concentration reached 256 ng/mL， the content of organic selenium in D. indica reached the maximum， which was 20.94 μg/g. [Conclusion] The optimum concentration of sodium selenite spraying on leaves of D. indica was 256 ng/mL. And the low concentration of inorganic selenium spraying on D. indica repeatedly was benefical for its absorption and transformtion.

Key words Duchesnea indica （Andr.） Focke；Na2SeO3；Forliar spraying；Selenium

蛇莓為薔薇科植物蛇莓（Duchesnea indica（Andr.）Focke）的全草，又名龍吐珠。性甘、苦、寒，有小毒。具有涼血消腫，清熱解毒，化痰止咳的功效。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，蛇莓具有抗癌細(xì)胞突變作用，其抗癌效果較強(qiáng)。目前，蛇莓與其他中草藥配伍可以治療食管癌、胃癌、肝癌、直腸癌、鼻咽癌、甲狀腺癌、胸腺癌、皮膚癌等多種癌癥[1]。

硒不但是人體必需的微量元素之一，而且也是“抗癌之王”[2]。若抗癌中草藥中的有效成分與硒形成植物有機(jī)硒，該有機(jī)硒可能具有功效更加獨(dú)特的療效。因此，從富硒抗癌中草藥中提取有機(jī)硒并對(duì)其進(jìn)行抗癌活性研究，將會(huì)成為尋找抗癌新藥的有效途徑之一。目前，雖然有學(xué)者從天然植物中提取出了部分有機(jī)硒化合物，如：甲基硒半光氨酸（MeSeCys，NH2-CH（CO2H）-CH2-Se-CH3）[3]、γ-谷胺酰-甲基硒代半光氨酸（γ-glutamyl-MeSeCys，NH2-CH（CO2H）-（CH2）2-CO-NH-CH（CO2H）-CH2-Se-CH3）[4]、硒代蛋氨酸（Se-Met，NH2-CH（CO2H）-CH2-CH2-Se-CH3）[5]、硒代半光氨酸（Se-Cys，NH2-CH（CO2H）-CH2-SeH）[5]、丙基硒代半胱氨酸（ProSeCys，NH2-CH（CO2H）-CH2-Se-CH2-CH2-CH3）[5]、硒代光氨酸（Se-Cys2，NH2-CH（CO2H）-CH2-Se-CH2-CH（CO2H）NH2）[6]，其中甲基硒半光氨酸（MeSeCys，NH2-CH（CO2H）-CH2-Se-CH3）[3]、γ-谷胺酰-甲基硒代半光氨酸（γ-glutamyl-MeSeCys，NH2-CH（CO2H）-（CH2）2-CO-NH-CH（CO2H）-CH2-Se-CH3）[4]已被證實(shí)具有較強(qiáng)的抗癌活性。但天然植物中有機(jī)硒的含量是有限的，很多有機(jī)硒化合物由于含量低而不能被檢測(cè)，因此從藥用植物中尋找抗癌有機(jī)硒化合物受到了限制。有學(xué)者研究表明，葉面噴硒能顯著提高植物體內(nèi)有機(jī)硒的含量[7-9]。鑒于此，筆者以具有抗癌活性的蛇莓作為研究對(duì)象，采用葉面噴施亞硒酸鈉的方法，探討葉面噴施亞硒酸鈉對(duì)蛇莓有機(jī)硒含量的影響，并篩選出富硒蛇莓的最佳亞硒酸鈉濃度，以便為下一步采用制備液相色譜法從富硒蛇莓中分離含硒有機(jī)物，以及將該有機(jī)硒化合物用于醫(yī)學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2013年6—12月在凱里學(xué)院富硒中草藥研究中心的溫室內(nèi)進(jìn)行。供試土壤為黃壤，為了增加土壤的肥力和透氣性，將黃壤、兔子糞和細(xì)木碎屑按2.0∶1.0∶0.5拌勻，并將等量的上述土壤裝入30個(gè)大盆（直徑30 cm，高度20 cm）中待用。供試蛇莓種子和亞硒酸鈉分別由沭陽(yáng)縣佳康園林綠化苗木場(chǎng)和上海晶純生化科技股份有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)處理共9個(gè)，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，以不噴硒為空白（CK）。自蛇莓幼苗長(zhǎng)出5～6片葉時(shí)，對(duì)其葉片的正反面進(jìn)行均勻噴硒。10個(gè)處理（CK，T1～T9）對(duì)應(yīng)的亞硒酸鈉溶液濃度分別為0、2、4、8、16、32、64、128、256、512 ng/mL，每次噴施亞硒酸鈉溶液100 mL，間隔時(shí)間為10 d，共噴硒10次。

1.3 項(xiàng)目測(cè)定

1.3.1 樣品的前處理。

噴硒結(jié)束后的第10天采摘蛇莓樣品，先將其裝滿自來(lái)水的大桶中漂洗5次，再用蒸餾水漂洗3次，然后將其自然晾干并放入70 ℃烘箱中干燥至恒重。干燥后的蛇莓樣品用小型粉碎機(jī)（HK-02A，旭朗機(jī)械成都分公司）粉碎并過(guò)200目篩，儲(chǔ)存于自封袋中待用。

1.3.2 硒標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配置（1 000 ng/mL）：準(zhǔn)確量取1 mL 硒標(biāo)準(zhǔn)溶液（BW079812，標(biāo)準(zhǔn)值：100 μg/g）于100 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，搖勻待用。

硒標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配置：準(zhǔn)確量取0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL的硒標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液于6個(gè)100 mL的容量瓶中，加入25 mL 濃鹽酸，用超純水定容至刻度，即得0、2、4、8、16、32 ng/mL的硒標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，搖勻待測(cè)。

1.3.3 總硒的提取。

蛇莓中總硒的提取在凱里學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院原子熒光分析室完成，并采用茍?bào)w忠等[10]建立的分析方法測(cè)定蛇莓樣品中的總硒。其簡(jiǎn)要分析流程為：稱取約0.500 0 g樣品于150 mL錐形瓶中，加入15 mL 混酸（VHNO3∶VHClO4=2∶1），冷消化過(guò)夜，并于電熱板上加熱樣品溶液至1 mL，加入5 mL濃鹽酸，再加熱樣品溶液至1 mL，取下冷卻，用超純水將樣品溶液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，并加入12.5 mL濃鹽酸，最后用超純水定容至刻度，搖勻待測(cè)。

1.3.4 無(wú)機(jī)硒的提取。

采用催海容等[11]建立的方法提取蛇莓中的無(wú)機(jī)硒。其簡(jiǎn)要流程為：準(zhǔn)確稱取1.000 0 g蛇莓樣品，置于50 mL離心管中，分2次加入25 mL超純水，超聲提取30 min，5 000 r/min條件下離心10 min，2次提取的上清液合并，再用等量的環(huán)己烷萃取1次，棄去有機(jī)相，水相轉(zhuǎn)入150 mL錐形瓶中，然后按“1.3.3”操作。

1.3.5 硒含量的測(cè)定。

樣品中的硒含量采用順序注射雙道原子熒光光度計(jì)（AFS-230E，北京海光儀器有限公司）進(jìn)行測(cè)定。

1.3.6 總硒/無(wú)機(jī)硒含量的計(jì)算。

總硒/無(wú)機(jī)硒含量（ng/g）=溶液濃度（ng/mL）×溶液總體積（mL）/取樣量（g）。

1.3.7 有機(jī)硒含量的計(jì)算。

有機(jī)硒含量=總硒含量-無(wú)機(jī)硒含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0和Origin 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用氫化物發(fā)生原子熒光譜法測(cè)定“1.3.2”中硒標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的熒光強(qiáng)度，以硒標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（C）為橫坐標(biāo)，以硒熒光強(qiáng)度（IF）為縱坐標(biāo)作圖（圖1），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為IF=56.54C+3.47，回歸系數(shù)r=1.000 0，表明硒濃度在0～32 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2 葉面噴硒對(duì)蛇莓總硒的影響

從表1可以看出，對(duì)蛇莓進(jìn)行葉面噴硒后其總硒含量從0.45 μg/g增加到35.12 μg/g，其最大值是CK的78.04倍。差異分析表明，其相鄰2個(gè)處理間總硒的含量均呈顯著性差異（見表1）。分析認(rèn)為，葉面噴硒對(duì)蛇莓總硒含量的影響較大。

2.3 葉面噴硒對(duì)蛇莓無(wú)機(jī)硒的影響

由表1可知，采用葉面噴硒后，蛇莓中的無(wú)機(jī)硒含量變化較大，無(wú)機(jī)硒含量從0.15 μg/g增加到18.49 μg/g，其最大值是CK值的126.06倍。差異分析表明，處理T1～T4 隨著噴硒濃度的增加不存在顯著性差異，但處理T5～T9存在顯著性差異。分析認(rèn)為，當(dāng)葉面噴硒濃度小于16 ng/mL時(shí)，蛇莓中無(wú)機(jī)硒的含量受葉面噴硒的影響不大，然而當(dāng)葉面噴硒濃度大于32 ng/mL時(shí)，蛇莓中無(wú)機(jī)硒的含量受葉面噴硒的影響較大。

2.4 葉面噴硒對(duì)蛇莓有機(jī)硒的影響

隨著葉面噴施亞硒酸鈉濃度的增加，有機(jī)硒含量逐漸增加，其值從0.30 μg/g逐漸增加到20.94 μg/g，當(dāng)蛇莓葉面噴硒濃度達(dá)到256 ng/mL時(shí)，蛇莓中有機(jī)硒的含量達(dá)到最大值，而當(dāng)噴硒濃度大于256 ng/mL時(shí)，蛇莓中有機(jī)硒的含量顯著降低（見表1）。差異分析表明，除了處理T1和T2之間不存在顯著性差異外，其他相鄰處理間均存在顯著性差異。分析認(rèn)為，采用葉面噴適當(dāng)濃度的亞硒酸鈉溶液能明顯增加蛇莓中的有機(jī)硒含量，噴施亞硒酸鈉溶液的濃度太高會(huì)降低蛇莓中的有機(jī)硒的含量。

2.5 葉面噴硒對(duì)蛇莓有機(jī)硒轉(zhuǎn)化率的影響

從表1可知，有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率從處理T1～T4逐漸增加，當(dāng)葉面噴施亞硒酸鈉濃度16 ng/mL，蛇莓中有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率達(dá)到90.5%。但從處理T5～T9逐漸降低，當(dāng)葉面噴施亞硒酸鈉濃度為512 ng/mL時(shí)，蛇莓中有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率降低到47.3%，該處理有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率遠(yuǎn)低于CK值。分析認(rèn)為，噴施亞硒酸鈉濃度16 ng/mL時(shí)最有利于將蛇莓中的無(wú)機(jī)硒轉(zhuǎn)化為有機(jī)硒。從表1的分析結(jié)果可知，雖然此處理有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率最高，但蛇莓中的有機(jī)硒含量尚未達(dá)到最大值。同時(shí)分析結(jié)果還表明，當(dāng)葉面噴施亞硒酸鈉濃度大于16 ng/mL時(shí)，蛇莓中有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率雖然有所降低，但是對(duì)比CK可以看出處理T6～T8的蛇莓有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率均高于CK。結(jié)果表明，葉面噴施亞硒酸鈉濃度小于或等于256 ng/mL時(shí)，蛇莓并沒(méi)有表現(xiàn)出硒中毒，但當(dāng)葉面噴施亞硒酸鈉濃度大于該濃度時(shí)，蛇莓表現(xiàn)出硒中毒，且有機(jī)硒的轉(zhuǎn)化率迅速降低。上述分析表明，蛇莓葉面噴施亞硒酸鈉的最佳濃度為256 ng/mL，并以此亞硒酸鈉濃度對(duì)蛇莓進(jìn)行噴施，可以獲得含20.94 μg/g有機(jī)硒的富硒蛇莓。

3 討論

前人研究表明，植物葉面噴硒能顯著提升植物體內(nèi)的硒含量[12-14]。該試驗(yàn)分析結(jié)果表明，葉面噴施亞硒酸鈉溶液顯著提升了蛇莓中的有機(jī)硒的含量，當(dāng)噴施亞硒酸鈉溶液濃度為256 ng/mL時(shí)，蛇莓中有機(jī)硒的濃度達(dá)到最大值（20.94 μg/g），是CK的69.8倍。紫云英是目前公認(rèn)的硒集聚植物[15]，張祥明等[13]以360 μg/mL的亞硒酸鈉溶液對(duì)紫云英進(jìn)行了3次噴施，并獲得了最大硒含量（總硒含量為13.54 μg/g）的富硒紫云英，為CK的148.79倍。然而，該試驗(yàn)采用256 ng/mL亞硒酸鈉溶液對(duì)蛇莓進(jìn)行10次噴施，獲得有機(jī)硒的含量為20.94 μg/g，高于上述紫云英中硒的最大值。分析認(rèn)為，采用低濃度的亞硒酸鈉溶液對(duì)植物進(jìn)行多次噴施的方法有利于植物對(duì)無(wú)機(jī)硒的吸收和轉(zhuǎn)化。

已有研究表明，蛇莓總酚對(duì)卵巢癌（SKOV-3）、宮頸癌（HeLa）、子宮內(nèi)膜癌（HEC-1B）、鼻咽癌（CNE）、胃癌（BGC-823）、肺癌（NCI-H460）細(xì)胞的增殖有良好的抑制作用[16-18]。同時(shí)，前人已證實(shí)了甲基硒半光氨酸（MeSeCys，NH2-CH（CO2H）-CH2-Se-CH3）[3]、γ-谷胺酰-甲基硒代半光氨酸（γ-glutamyl-MeSeCys，NH2-CH（CO2H）-（CH2）2-CO-NH-CH（CO2H）-CH2-Se-CH3）[4]等有機(jī)硒具有較強(qiáng)的抗癌活性。由于有機(jī)硒的藥效遠(yuǎn)高于無(wú)機(jī)硒，因此若蛇莓中的抗癌活性成分與硒結(jié)合，可能會(huì)生成對(duì)癌癥有獨(dú)特療效的含硒活性成分。然而，含硒活性成分必須從有機(jī)硒含量很高的蛇莓中提取，在自然條件下生長(zhǎng)的蛇莓有機(jī)硒含量很低，很難從中提取含硒活性成分。該研究通過(guò)葉面噴硒的方式獲得了有機(jī)硒高度富集的蛇莓，并有可能從富硒蛇莓中提取對(duì)癌細(xì)胞有顯著抑制活性的含硒活性成分。由于該試驗(yàn)采用盆栽方式對(duì)蛇莓進(jìn)行富硒培育，所以獲得的富硒蛇莓樣品較少，因此尚未對(duì)富硒蛇莓中有機(jī)硒的賦存形態(tài)進(jìn)行系統(tǒng)的分析。目前，筆者已在室外對(duì)蛇莓進(jìn)行大量的種植，并利用該研究成果對(duì)蛇莓進(jìn)行富硒培育，然后對(duì)富硒蛇莓進(jìn)行有機(jī)硒的提取，并用制備液相色譜法分離出不同成分的有機(jī)硒，再采用核磁共振、紅外光譜、高效液相色譜-質(zhì)譜連用等技術(shù)表征有機(jī)硒的結(jié)構(gòu)，最后將分離出來(lái)的有機(jī)硒進(jìn)行抗癌活性的檢測(cè)，以期為天然含硒抗癌新藥的研制提供重要參考。

4 結(jié)論

葉面噴施亞硒酸鈉能有效增加蛇莓葉中有機(jī)硒的含量，采用256 ng/mL的亞硒酸鈉溶液對(duì)蛇莓葉面進(jìn)行10次噴施，每10 d噴硒1次可以獲得有機(jī)硒含量較高的富硒蛇莓，其有機(jī)硒含量高達(dá)20.94 μg/g。

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