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摘要 [目的]探究外源添加尿黑酸對(duì)擬南芥酪氨酸降解途徑的影響。[方法]以擬南芥野生型和酪氨酸降解途徑缺陷突變體sscd1、hgo為材料，通過在培養(yǎng)基中添加不同濃度尿黑酸，分析長、短日照下對(duì)種子萌發(fā)的影響。[結(jié)果]在長、短日照下，外源添加0.1～0.4 mmol/L濃度尿黑酸推遲sscd1突變體種子萌發(fā)；外源添加0.8 mmol/L濃度尿黑酸抑制sscd1突變體種子萌發(fā)，而該濃度的尿黑酸對(duì)野生型和hgo突變體種子萌發(fā)沒有影響。另外，在培養(yǎng)基中添加酪氨酸降解途徑的異常代謝產(chǎn)物——琥珀酰丙酮，在長日照下也能抑制野生型種子萌發(fā)。[結(jié)論]尿黑酸處理后激活了酪氨酸降解途徑，使sscd1突變體中積累較多的琥珀酰丙酮從而影響其種子萌發(fā)。

關(guān)鍵詞 擬南芥；sscd1突變體；酪氨酸降解途徑；尿黑酸；琥珀酰丙酮；種子萌發(fā)

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）17-0092-04

Abstract [Objective]To investigate the effects of homogentisate on the tyrosine degradation pathway in Arabidopsis thaliana.[Method]Wildtype and tyrosine pathwaydeficient mutants （sscd1，hgo） of A. thaliana were used as materials to study the effects on seeds germination by adding different concentration of homogentisate under long or short day. [Result]The seeds germination of sscd1 mutant would be delayed by homogentisate with the concentration of 0.1-0.4 mmol/L under long or short day. The germination of sscd1 mutant was inhibited by 0.8 mmol/L homogentisate，while it had no effect on germination of wildtype and hgo mutant. In addition，succinylacetone，an abnormal metabolite of the tyrosine degradation pathway，also inhibited the germination of wildtype seeds under long day.[Conclusion]The tyrosine degradation pathway was activated with the treatment of homogentisate，thereby affecting the germination of the sscd1 mutant with succinylacetone accumulated.

Key words Arabidopsis thaliana；sscd1 mutant；Tyrosine degradation pathway；Homogentisate；Succinylacetone；Seed germination

對(duì)動(dòng)物來說，酪氨酸降解是一條很重要的代謝途徑。在動(dòng)物體內(nèi)，酪氨酸先由酪氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶催化生成對(duì)羥基苯丙酮酸，然后被對(duì)羥基苯丙酮酸雙氧化酶催化生成尿黑酸（homogentisate），再經(jīng)尿黑酸1，2—雙加氧酶（homogentisate dioxygenase，HGO）作用氧化形成馬來酰乙酰乙酸（maleyl acetoacetate，MAA），后者經(jīng)馬來酰乙酰乙酸異構(gòu)酶作用形成延胡索酰乙酰乙酸（fumaroylacetoacetate，F(xiàn)AA），之后在延胡索酰乙酰乙酸酶（fumarylacetoacetate hydrolase，F(xiàn)AH）的作用下形成乙酰乙酸和延胡索酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)徹底分解[1-4]。

植物信號(hào)傳導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室前期通過EMS誘導(dǎo)法分離了一種在短日照條件下發(fā)生細(xì)胞死亡的擬南芥突變體sscd1[5]。這種突變體在短日照條件下的MS培養(yǎng)基上全部萌芽，培養(yǎng)一段時(shí)間后葉片會(huì)出現(xiàn)先萎蔫后白化的現(xiàn)象。采用臺(tái)盼藍(lán)染色的方法證實(shí)了突變體sscd1萎蔫處發(fā)生細(xì)胞死亡[6]。通過基因定位和序列分析發(fā)現(xiàn)sscd1基因編碼酪氨酸降解途徑的最后一個(gè)酶FAH。酪氨酸降解途徑在動(dòng)物中是必不可少的，F(xiàn)AH缺失會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物先天性致死。FAH基因發(fā)生突變將導(dǎo)致中間代謝產(chǎn)物MAA、FAA的積累，一旦MAA和FAA在體內(nèi)積累將會(huì)引起異常代謝，并轉(zhuǎn)化為琥珀酰乙酰乙酸（succinylacetoacetate，SAA），并且SAA進(jìn)一步自發(fā)經(jīng)過非酶促的脫羧反應(yīng)形成琥珀酰丙酮（succinylacetone，SUAC）[7]。前期研究發(fā)現(xiàn)，在植物中，SUAC在短日照下才出現(xiàn)積累，長日照下則不會(huì)[8]。然而，酪氨酸降解途徑在植物中的作用仍有待闡明。該試驗(yàn)以擬南芥野生型Col-0和酪氨酸降解途徑缺陷突變體sscd1、hgo為研究材料，通過外源添加尿黑酸處理的方法來研究長、短日照下Col-0、sscd1和hgo萌發(fā)的變化。探究尿黑酸對(duì)擬南芥酪氨酸降解途徑的影響，并對(duì)尿黑酸在植物體內(nèi)的作用做進(jìn)一步了解。

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥（Arabidopsis thaliana）野生型Columbia（Col-0，WT）、酪氨酸降解缺陷突變體sscd1和hgo，全部由植物信號(hào)傳導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試劑與儀器

尿黑酸（東京化成工業(yè)株式會(huì)社D1050，1 g，日本）；MS培養(yǎng)基粉（Phyto technology laboratories M519，100 L，美國）；SYBR（Roche 04913914001，100 mL，瑞士）；蔗糖；瓊脂粉（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；智能人工氣候箱（PRX-450B，賽福）。

1.3 方法

1.3.1 尿黑酸、琥珀酰丙酮母液配制及添加。

稱取0.336 g尿黑酸溶于20 mL 30%丙酮溶液中，配制成100 mmol/L母液，抽濾滅菌，置于-20 ℃避光保存。使用時(shí)取不同體積尿黑酸母液加入MS培養(yǎng)基中混勻，配制成含不同濃度尿黑酸的MS培養(yǎng)基。

稱取0.024 g琥珀酰丙酮溶于100 μL丙酮配制成100 μg/mL母液。使用時(shí)取不同體積琥珀酰丙酮母液加入MS培養(yǎng)基中混勻，配制成含不同濃度琥珀酰丙酮的MS培養(yǎng)基。

1.3.2 擬南芥的培養(yǎng)。

1.3.2.1 尿黑酸處理培養(yǎng)。擬南芥種子用消毒液（20%bleach+0.1%Triton 100）處理10～12 min，隨后置于超凈工作臺(tái)上將消毒水去除并用無菌水清洗種子3～4次后懸浮于0.1%瓊脂溶液中，鋪種在含1%蔗糖和不含或分別含有0.1、0.2、0.4、0.8 mmol/L尿黑酸的MS培養(yǎng)基上，放置4 ℃冰箱春化3 d，再置于光周期為長日照（long day，16 h光照，8 h黑暗）和短日照（short day，8 h光照，16 h黑暗）的人工氣候箱生長，培養(yǎng)溫度設(shè)置為（22±2）℃，光照強(qiáng)度設(shè)置為80～120 lx，相對(duì)濕度設(shè)置為65%。

1.3.2.2 琥珀酰丙酮處理培養(yǎng)。擬南芥種子用消毒液（20%bleach+0.1%Triton 100）處理10～12 min，隨后置于超凈工作臺(tái)上將消毒水去除并用無菌水清洗種子3～4次后懸浮于0.1%瓊脂溶液中，鋪種在含1%蔗糖和不含或分別含有60、120、240 μg/mL琥珀酰丙酮（SUAC）的MS培養(yǎng)基上，放置4 ℃下春化3 d，再置于光周期為8 h光照和16 h黑暗的人工氣候箱生長，培養(yǎng)溫度設(shè)置為（22±2）℃，光照強(qiáng)度設(shè)置為80～120 lx，相對(duì)濕度設(shè)置為65%。

1.4 測(cè)定方法及指標(biāo)

選取長、短日照條件下尿黑酸處理的擬南芥材料，分別對(duì)野生型、hgo和sscd1突變體材料的萌發(fā)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。尿黑酸處理后的種子萌發(fā)率/未處理野生型的種子萌發(fā)率即為種子的相對(duì)萌發(fā)率，選取經(jīng)SUAC處理的野生型和sscd1突變體材料，分別對(duì)2種材料的萌發(fā)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，SUAC處理后萌發(fā)的種子數(shù)/鋪種的全部種子數(shù)即為種子的萌發(fā)率，結(jié)果為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 尿黑酸處理影響sscd1突變體的種子萌發(fā)

為了進(jìn)一步研究外源添加尿黑酸對(duì)酪氨酸降解途徑的影響，對(duì)長、短日照條件下生長1、2 d的種子相對(duì)萌發(fā)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)（圖1），長日照下生長1 d，野生型、hgo和sscd1突變體在不含尿黑酸情況下相對(duì)萌發(fā)率差別不大；外源添加尿黑酸對(duì)野生型和hgo突變體的相對(duì)萌發(fā)率也無明顯影響，而sscd1突變體的相對(duì)萌發(fā)率隨著尿黑酸濃度的增加顯著降低，在0～0.8 mmol/L范圍內(nèi)相對(duì)萌發(fā)率分別為100%、75.5%、67.2%、59.7%和27.0%（圖1A）。短日照萌發(fā)情況與長日照類似，外源添加尿黑酸對(duì)野生型和hgo突變體的相對(duì)萌發(fā)率影響不大，sscd1突變體的相對(duì)萌發(fā)率同樣隨著尿黑酸濃度增加而逐漸降低（圖1B）。無論長日照還是短日照，生長2 d時(shí)，sscd1突變體相對(duì)萌發(fā)率都有明顯上升（圖1C、1D）。

長、短日照1 d，尿黑酸對(duì)sscd1突變體萌發(fā)有明顯抑制作用，其中長日照對(duì)萌發(fā)的抑制效果比短日照更明顯（圖1A、1B）。生長2 d，尿黑酸對(duì)sscd1突變體萌發(fā)的抑制作用明顯減弱：在0～0.4 mmol/L濃度范圍內(nèi)，對(duì)sscd1突變體萌發(fā)抑制減弱，甚至在0.1、0.2 mmol/L 濃度下相對(duì)萌發(fā)率恢復(fù)到與野生型和hgo突變體一致；濃度為0.4 mmol/L時(shí)仍存在抑制作用，但是短日照比長日照抑制更明顯；當(dāng)濃度增加至0.8 mmol/L后，長、短日照下萌發(fā)率基本一致（圖1C、1D）。生長2 d，未萌發(fā)種子不再萌發(fā)，長、短日照培養(yǎng)5 d后，野生型和hgo突變體基本萌發(fā)，而sscd1突變體有大部分未萌發(fā)（圖2）。這表明低濃度尿黑酸延遲擬南芥種子萌發(fā)，高濃度

2.2 琥珀酰丙酮（SUAC）處理影響野生型擬南芥的種子萌發(fā)

前期研究發(fā)現(xiàn)sscd1突變體在短日照下積累SUAC，該物質(zhì)是FAH功能失活后酪氨酸降解異常產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。為了探究作為中間代謝產(chǎn)物的SUAC對(duì)擬南芥種子萌發(fā)的影響，對(duì)長日照條件下SUAC處理的種子萌發(fā)率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)（圖3）：未添加SUAC生長1 d（LD-1）時(shí)萌發(fā)率最高為85.5%；添加60 μg/mL SUAC后萌發(fā)率為71.0%；添加120 μg/mL SUAC后萌發(fā)率為68.5%；添加240 μg/mL SUAC后萌發(fā)率為57.5%。生長3 d時(shí)，不同濃度SUAC處理的野生型材料萌發(fā)率都呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，不含或分別含有60、120和240 μg/mL SUAC的萌發(fā)率分別為100%、80.5%、75.0%、65.0%。繼續(xù)長日照培養(yǎng)8 d后發(fā)現(xiàn)，不含SUAC處理的培養(yǎng)基中，野生型正常生長（圖4A）；SUAC含量達(dá)60、120 μg/mL時(shí)，種子萌發(fā)和幼苗生長都開始受到抑制（圖4B、4C），且SUAC含量達(dá)120 μg/mL后，幼苗葉片開始出現(xiàn)白化死亡表型（圖4C）；隨著SUAC含量的繼續(xù)上升，種子萌發(fā)和幼苗生長受到強(qiáng)烈抑制（圖4D）。這表明，添加SUAC處理抑制了野生型種子的萌發(fā)，且隨著濃度升高抑制明顯，未接受處理則不受影響。

3 討論

尿黑酸作為酪氨酸降解途徑的一個(gè)重要中間代謝產(chǎn)物，它對(duì)酪氨酸降解途徑正常代謝起著至關(guān)重要的作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，引起死亡的原因是酪氨酸降解途徑的中斷，導(dǎo)致中間代謝產(chǎn)物MAA和FAA的積累，這些代謝產(chǎn)物將會(huì)毒害動(dòng)物的細(xì)胞和組織，最終引起動(dòng)物死亡[9-10]。當(dāng)FAH基因失活，將導(dǎo)致中間代謝產(chǎn)物MAA、FAA的積累，并引起代謝異常，MAA和FAA轉(zhuǎn)化為SAA，接著SAA經(jīng)過自發(fā)的非酶促脫羧反應(yīng)形成SUAC[7]。SUAC對(duì)生物細(xì)胞有毒害作用，SUAC在體內(nèi)積累會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡[11]。編碼酪氨酸降解途徑第三步酶HGO的基因發(fā)生突變后能阻斷中間代謝產(chǎn)物MAA和SAA的產(chǎn)生，所以在hgo突變體中不會(huì)產(chǎn)生SUAC。通過外源添加SUAC試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)一定濃度SUAC能夠加速sscd1突變體細(xì)胞死亡，而這種細(xì)胞死亡是因?yàn)橹虚g代謝產(chǎn)物SUAC積累所引起[8]。在該研究中，長、短日照條件下sscd1突變體的種子萌發(fā)均受到了明顯抑制，說明添加尿黑酸促進(jìn)了酪氨酸降解，使sscd1突變體中酪氨酸降解途徑異常代謝產(chǎn)物SUAC的積累增多，從而抑制種子萌發(fā)。一定濃度的尿黑酸處理野生型和hgo突變體，對(duì)幼苗萌發(fā)沒有明顯的影響，這是因?yàn)樵谝吧椭欣野彼峤到馔緩绞峭暾?，它自身能夠?qū)σ欢慷嘤嗟闹虚g代謝產(chǎn)物進(jìn)行代謝；而在hgo突變體中，HGO的缺失雖然不能將尿黑酸通過酪氨酸降解途徑分解代謝，但尿黑酸可能走其他的代謝途徑，比如維生素E合成途徑[12]。長、短日照下添加0.1～0.4 mmol/L尿黑酸對(duì)sscd1突變體種子萌發(fā)有延緩作用，而添加0.8 mmol/L尿黑酸對(duì)sscd1突變體種子萌發(fā)有抑制作用。這是因?yàn)橥庠刺砑幽蚝谒?，促進(jìn)了酪氨酸代謝途徑的中間代謝產(chǎn)物積累（MAA、FAA、SAA和SUAC），未萌發(fā)時(shí)不能代謝過量的中間代謝產(chǎn)物，從而抑制了種子萌發(fā)；由于尿黑酸本身就具有一定的毒性，在動(dòng)物體中如果尿黑酸過量，嚴(yán)重時(shí)會(huì)患上尿黑癥[13]。在培養(yǎng)時(shí)也發(fā)現(xiàn)了類似情況，當(dāng)外源添加尿黑酸濃度過高時(shí)，擬南芥種皮顏色會(huì)變?yōu)楹诤稚?，且sscd1突變體幼苗子葉也會(huì)褐化。這一結(jié)果與外源添加SUAC結(jié)果一致[8]。為了驗(yàn)證以上結(jié)果，進(jìn)行了外源添加SUAC試驗(yàn)。擬南芥野生型體內(nèi)酪氨酸降解途徑是正常的，外源添加SUAC后，發(fā)現(xiàn)添加SUAC抑制了種子萌發(fā)，隨著濃度的增加，抑制作用越強(qiáng)。說明SUAC能夠抑制種子萌發(fā)，在酪氨酸降解途徑正常情況下，植物自身能夠代謝少量的SUAC，從而在培養(yǎng)幾天后種子萌發(fā)能得到恢復(fù)，但超過植物自身代謝量后，會(huì)造成毒害作用且抑制種子萌發(fā)和細(xì)胞發(fā)生死亡。該結(jié)果也進(jìn)一步證明了酪氨酸降解途徑異常代謝產(chǎn)物SUAC的積累過多，抑制了sscd1突變體種子的萌發(fā)。

4 結(jié)論

利用生理分析的方法，發(fā)現(xiàn)尿黑酸處理能激活酪氨酸降

解途徑，加速植物體內(nèi)酪氨酸降解途徑，使sscd1突變體中

SUAC的積累增多，從而抑制sscd1突變體種子的萌發(fā)。

參考文獻(xiàn)

[1] APONTE J L，SEGA G A，HAUSER L J，et al.Point mutations in the murine fumarylacetoacetate hydrolase gene：Animal models for the human genetic disorder hereditary tyrosinemia type 1[J].Proceedings of the national academy of sciences of the USA，2001，98（2）：641-645.

[2] DIXON D P，EDWARDS R.Enzymes of tyrosine catabolism in Arabidopsis thaliana[J].Plant science：An international journal of experimental plant biology，2006，171（3）：360-366.

[3] GROMPE M，ALDHALMY M，F(xiàn)INEGOLD M，et al.Loss of fumarylacetoacetate hydrolase is responsible for the neonatal hepatic dysfunction phenotype of lethal albino mice[J].Genes & development，1994，7（12A）：2298-2307.

[4] HAN C Y，REN C M，ZHI T T，et al.Disruption of fumarylacetoacetate hydrolase causes spontaneous cell death under shortday conditions in Arabidopsis[J].Plant physiology，2013，162（4）：1956-1964.

[5] 韓成云.擬南芥短日照依賴型模擬病斑SDL1基因的分離和功能分析[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[6] 支添添，周舟，韓成云，等.臺(tái)盼藍(lán)染色鑒定擬南芥sdl1突變體的細(xì)胞死亡[J].作物研究，2013，27（3）：217-218.

[7] LINDBLAD B，LINDSTEDT S，STEEN G.On the enzymic defects in hereditary tyrosinemia[J].Proceedings of the national academy of sciences of the United States of America，1997，74（10）：4641-4645.

[8] 支添添.擬南芥sscd1突變體細(xì)胞死亡機(jī)理的研究[D].長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014.

[9] KVITTINGEN E A.Hereditary tyrosinemia type I：An overview[J].Scandinavian journal of clinical &laboratory investigation supplementum，1986，184（6）：27-34.

[10] JORQUERA R，TANGUAY RM.Fumarylacetoacetate，the metabolite accumulating in hereditary tyrosinemia，activates the ERK pathway and induces mitotic abnormalities and genomic instability[J].Human molecular genetics，2001，10（17）：1741-1752.

[11] FISHER A L，PAGE K E，LITHGOW G J，et al.The Caenorhabditis elegans K10C2.4 gene encodes a member of the fumarylacetoacetate hydrolase family：A Caenorhabditis elegans model of type I tyrosinemia[J].Journal of biological chemistry，2008，283（14）：9127-9135.

[12] DEAN D P，ROBERTL L.Progress in the dissection and manipulation of plant vitamin E biosynthesis[J].Physiologia plantarum，2006，126（3）：356-368.

[13] SCRIVER C R，CLOW C L.Phenylketonuria and other phenylalanine hydroxylation mutants in man[J].Annual review of genetics，1980，14（1）：179-202.