袁媛　孫葉　李風(fēng)童　包建忠　陳秀蘭

摘要 [目的]構(gòu)建適合春蘭SRAP-PCR反應(yīng)的最佳體系。[方法]對(duì)影響PCR反應(yīng)的5個(gè)變量（dNTPs濃度、Mg2+濃度、引物濃度、Taq酶量、模板DNA用量）采用L16（45）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立春蘭SRAP-PCR最適反應(yīng)體系。[結(jié)果]最佳優(yōu)化體系為0.25 mmol/L dNTPs、2.50 mmol/L Mg2+、0.80 μmol/L引物、1.00 U Taq酶、200.00 ng模板DNA，共20 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性4 min，反應(yīng)前5個(gè)循環(huán)在94 ℃變性1 min、35 ℃復(fù)性1 min、72 ℃延伸1 min的條件下運(yùn)行，隨后的30個(gè)循環(huán)復(fù)性溫度提高至50 ℃，最后72 ℃延伸10 min。[結(jié)論]該體系有利于SRAP分子標(biāo)記在春蘭材料上的應(yīng)用，為春蘭分子遺傳育種奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 春蘭；SRAP-PCR；正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)；體系優(yōu)化

中圖分類(lèi)號(hào) S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）17-0105-03

Abstract [Objective]To establish the suitable SRAPPCR reaction system for Cymbidium goeringii .[Method] L16（45） of orthogonal design was used to optimize SRAPPCR of C. goeringii in 5 factors such as dNTPs concentration， Mg2+ concentration， primer concentration， Taq DNA polymerase amount and DNA template amount. [Result]The optimized system was as follows： a total volume of 20 μL including 0.25 mmol/L dNTPs， 2.50 mmol/L Mg2+， 0.80 μmol/L primer， 1.00 U Taq DNA polymerase， 200.00 ng DNA template. The suitable SRAPPCR procedure was 4 min of denaturing at 94 ℃， five cycles of three steps， 1 min of denaturing at 94 ℃， 1 min of annealing at 35 ℃ and 1 min of elongation at 72 ℃， in the following 30 cycles， the annealing temperature was increased to 50 ℃， with a final elongation step of 10 min at 72 ℃. [Conclusion]The SRAPPCR reaction system for SRAP markers of C. goeringii could be applied in C. goeringii molecular genetics research.

Key words Cymbidium goeringii；SRAPPCR；Orthogonal experiment design；Optimization of reaction system

蘭科（Orchidaceae）是開(kāi)花植物中最大科之一，擁有25 000多個(gè)種[1]。春蘭（Cymbidium geringii）屬于蘭科蘭屬多年生草本植物，其花幽香，葉姿秀美，具有較高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。長(zhǎng)期的自然雜交和人工選育使得各變種及自然雜交種不斷出現(xiàn)，傳統(tǒng)的鑒定方法已不能較為系統(tǒng)地鑒定春蘭品種間的親緣關(guān)系。僅憑葉色、葉型、花色、花型和花梗等傳統(tǒng)形態(tài)指標(biāo)來(lái)辨識(shí)品種存在很大難度，也影響新品種的注冊(cè)登錄和產(chǎn)權(quán)保護(hù)[2]。因此，利用分子標(biāo)記技術(shù)研究春蘭分類(lèi)及種質(zhì)資源遺傳多樣性評(píng)價(jià)就顯得相當(dāng)必要。

序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性標(biāo)記（sequence related amplified olymorphism，SRAP）是Li和Quiros發(fā)展的一種新的分子標(biāo)記技術(shù)[3]，具有簡(jiǎn)便、快捷、穩(wěn)定、高效、共顯性高及在基因組中分布均勻等特點(diǎn)。它針對(duì)基因外顯子富含GC而啟動(dòng)子和內(nèi)含子富含AT的特點(diǎn)來(lái)設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增，因不同個(gè)體以及物種的內(nèi)含子、啟動(dòng)子與間隔長(zhǎng)度不等而產(chǎn)生多態(tài)性[4]。目前該技術(shù)已成功應(yīng)用于對(duì)水稻[5]、小麥[6]、甜瓜[7]、野牛草[8]、辣椒[9]、棉花[10]等植物的研究中。該研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)影響春蘭SRAP-PCR反應(yīng)體系的dNTPs濃度、Mg2+濃度、引物濃度、Taq酶和模板DNA用量這5個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)，旨在建立適用于春蘭的SRAP-PCR反應(yīng)體系，為今后進(jìn)一步利用SRAP分子標(biāo)記開(kāi)展蘭花種質(zhì)資源鑒定和遺傳圖譜構(gòu)建等研究工作打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所花圃中的春蘭嫩葉為試材，取樣后-20 ℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)前期試驗(yàn)，引物Me1/Em7（Me1：5′-TGAGTCCAAACCGGATA-3′，Em7：5′-GACTGCGTACGAATTCAA-3′）對(duì)春蘭具有良好的條帶可讀性和多態(tài)性，故選其為此次正交試驗(yàn)的固定引物。

1.2 DNA提取和質(zhì)量檢測(cè)

采用改良的CTAB法提取基因組DNA[11]，溶解于TE溶液。DNA的濃度和純度測(cè)定使用OneDrop1000超微量分光光度計(jì)，選用OD260/OD280在1.7～1.9的DNA，將DNA稀釋至所需的濃度（50 ng/μL），-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR反應(yīng)體系正交設(shè)計(jì)

選用L16（45）正交設(shè)計(jì)表，對(duì)影響PCR反應(yīng)體系的5個(gè)主要因素（dNTPs濃度、Mg2+濃度、引物濃度、Taq酶和模板DNA用量）在4個(gè)水平上進(jìn)行試驗(yàn)，PCR反應(yīng)因素水平見(jiàn)表1，L16（45）設(shè)計(jì)方案見(jiàn)表2。SRAP-PCR反應(yīng)體系共20 μL，包括5個(gè)因素的不同水平，每個(gè)體系添加2.00 μL的10×Buffer，加ddH2O至終體積。正交設(shè)計(jì)共16個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.4 SRAP-PCR的擴(kuò)增及檢測(cè)

SRAP-PCR擴(kuò)增反應(yīng)在Agilent Sure Cycler 8800 PCR儀中進(jìn)行。擴(kuò)增程序如下：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，35 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性1 min，50 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖（含溴化乙錠）電泳檢測(cè)，電泳緩沖液為1×TAE，90 V穩(wěn)壓1 h，于凝膠成像儀上觀察并照相記錄。

1.5 最佳反應(yīng)體系的檢測(cè)

選取Me1/Em7和Me11/Em8（Me11：5′-TGAGTCCAAACCGGTGC-3′，Em8：5′- GACTGCGTACGAATTCA-3′）對(duì)16份春蘭材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳并染色后，在紫外成像系統(tǒng)上拍照檢測(cè)，來(lái)驗(yàn)證反應(yīng)體系的穩(wěn)定性和可行性。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

采用不同的反應(yīng)體系，春蘭基因組DNA的SRAP-PCR擴(kuò)增電泳圖譜見(jiàn)圖1。從圖1可以看出，不同dNTPs濃度、Mg2+濃度、引物濃度、Taq酶量和模板DNA用量的16個(gè)反應(yīng)體系，擴(kuò)增結(jié)果存在明顯差異。第1、5、9、13和14號(hào)反應(yīng)體系無(wú)擴(kuò)增；第6、15、16號(hào)反應(yīng)體系擴(kuò)增條帶模糊，彌散嚴(yán)重；第2、3、4、7、8和10號(hào)反應(yīng)體系擴(kuò)增條帶中有1條較亮，其他條帶較弱且模糊不清晰；第11號(hào)反應(yīng)體系擴(kuò)增條帶較多，強(qiáng)弱均勻且清晰可辨，是比較理想的擴(kuò)增模式。綜上所述，選定第11號(hào)反應(yīng)體系（含0.25 mmol/L dNTPs、2.50 mmol/L Mg2+、0.80 μmol/L引物、1.00 U Taq酶、200.00 ng模板DNA）作為春蘭基因組DNA的SRAP-PCR反應(yīng)體系。

2.2 優(yōu)化的反應(yīng)體系穩(wěn)定性

應(yīng)用該最佳反應(yīng)體系，利用引物Me1/Em7和Me11/Em8 對(duì)16份春蘭材料進(jìn)行SRAP-PCR擴(kuò)增，得到清晰、多態(tài)性高的SRAP譜帶（圖2），且具有較好的穩(wěn)定性。說(shuō)明該體系較穩(wěn)定，適用于春蘭SRAP-PCR反應(yīng)。

3 討論

SRAP是一種基于PCR的新型分子標(biāo)記，最早是在蕓薹屬作物中開(kāi)發(fā)出來(lái)的，現(xiàn)已成功應(yīng)用在多種作物的種質(zhì)資源鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、比較基因組學(xué)研究等方面[12]。SRAP標(biāo)記正向引物可特異結(jié)合開(kāi)放閱讀框（ORF）區(qū)域中的外顯子，反向引物可特異結(jié)合啟動(dòng)子和內(nèi)含子區(qū)域，由于不同個(gè)體及物種內(nèi)含子、啟動(dòng)子間間隔長(zhǎng)度不同而產(chǎn)生多態(tài)性[13]。SRAP比RAPD重復(fù)性、穩(wěn)定性好，與AFLP相比，操作簡(jiǎn)便、成本更低，相比SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單[14]，但同樣受到反應(yīng)條件和擴(kuò)增程序變化的影響，因此有必要對(duì)春蘭基因組DNA的SRAP-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化。

筆者采用正交試驗(yàn)方法，建立了春蘭SRAP-PCR的反應(yīng)體系：0.25 mmol/L dNTPs、2.50 mmol/L Mg2+、0.80 μmol/L引物、1.00 U Taq酶、200.00 ng模板DNA，共20 μL。同時(shí)，利用2對(duì)引物對(duì)16份春蘭材料進(jìn)行擴(kuò)增，檢驗(yàn)了該SRAP-PCR反應(yīng)體系的穩(wěn)定性。春蘭SRAP-PCR優(yōu)化體系的建立為以后應(yīng)用SRAP分子標(biāo)記研究蘭花資源及其他近緣種的遺傳多樣性提供了參考。

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