葉乃瑋 王承芳 耿稞 張信旺 毛偉力

摘要 [目的]探討木霉菌油懸浮劑組合施藥防治獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病的效果。[方法]通過(guò)液體發(fā)酵和劑型處理，將木霉（Trichoderma spp.）菌株Tr309T制成含2×108個(gè)/g或 2×108個(gè)/mL 分生孢子的可濕性粉劑（WP）或油懸浮劑（SC），于2016和2017年在上?；芫G農(nóng)場(chǎng)進(jìn)行單項(xiàng)施藥（灌根、噴霧、涂抹）和組合施藥[噴霧+涂抹（A）或灌根+噴霧+涂抹（B）]對(duì)比試驗(yàn)，測(cè)定它們對(duì)獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病的防治效果。[結(jié)果]經(jīng)Tr309T-WP、Tr309T-SC所進(jìn)行的單項(xiàng)施藥處理的病情指數(shù)、防治效果和病斑治愈率，均分別顯著高于或低于化學(xué)藥劑處理；而經(jīng)Tr309T-SC或2%潰腐靈SC的組合施藥方式A或B處理的獼猴桃植株的病情指數(shù)和防治效果均分別顯著低于或高于Tr309T-WP和病原對(duì)照組合施藥處理。[結(jié)論]該研究結(jié)果為獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病的生物防治提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 獼猴桃潰瘍??；油懸浮劑；木霉菌；組合施藥

中圖分類號(hào) S436.634.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）17-0161-04

Abstract [Objective] The aim was to explore the control effect of combined application methods of an oilbased suspension with Trichoderma spp. on bacterial canker of kiwi. [Method] By the processes of liquid fermentation and formulation， a wettable powder （WP） and an oilbased suspension （SC） formulations containing 2×108 individuals/g or 2×108 individuals/mL conidial spores of Trichoderma spp. strain Tr309T were made and used to conduct individual application tests of root drench， spraying and coating or in a combination of spraying + coating （A） or root drench + spraying + coating （B） on controlling the disease of bacterial canker of kiwi. [Result] The disease severity and efficacy rate of disease control in the treatments of root drench， spraying or coating with Tr309TWP or Tr309TSC were all significantly higher or lower， respectively， than those with the treatment of 2% atractylodin + magnolol SC. On the other hand， the disease severity and efficacy rate of disease control in the treatments with combined application of A or B with Tr309TSC or the treatment of 2% atractylodin + magnolol SC were significantly lower or higher， respectively， than those with the treatments of Tr309TWP and pathogen control. [Conclusion] The results provide reference for the biological control of bacterial canker of kiwi.

Key words Bacterial canker of kiwi；Oilbased suspension formulation；Trichoderma spp.；Combined application

獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病是一種由丁香假單胞桿菌-獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv.actinidiae，PSA）侵染，并嚴(yán)重威脅獼猴桃生產(chǎn)和發(fā)展的毀滅性病害。該病害具有致病性強(qiáng)、傳播快、發(fā)生范圍廣、防治難度大等特點(diǎn)，在短期內(nèi)可造成大面積樹(shù)體死亡，已被國(guó)家列為中國(guó)森林植物檢疫性病害[1]。1980年該病首次在美國(guó)加利福尼亞州和日本的神州靜岡縣發(fā)現(xiàn)[2]。方炎祖等[3] 于1985年在湖南省東山峰農(nóng)場(chǎng)的獼猴桃果園中首次發(fā)現(xiàn)了該病，當(dāng)年的發(fā)病面積就從一個(gè)點(diǎn)擴(kuò)展到13 hm2。該病菌主要通過(guò)風(fēng)、雨、昆蟲(chóng)、農(nóng)具等媒介進(jìn)行傳播。雨水充足易使PSA菌量增加，降水量與病害的流行程度有顯著相關(guān)性[4-5]。

目前，生產(chǎn)上對(duì)獼猴桃潰瘍病的防治主要通過(guò)農(nóng)田管理和化學(xué)農(nóng)藥。李泉廠等[6]研究表明，使用72%農(nóng)用鏈霉素和46%可殺得，對(duì)發(fā)病初期的獼猴桃植株有一定的防治作用，但對(duì)進(jìn)入發(fā)病盛期植株的防治效果不明顯。由于病原菌對(duì)多種化學(xué)農(nóng)藥的抗藥性日益加重，導(dǎo)致農(nóng)用鏈霉素對(duì)該病害的防治效果愈來(lái)愈差。目前市面上還未出現(xiàn)一種能有效防治獼猴桃潰瘍病的化學(xué)藥劑[7]。馮華等[8]研究指出，通過(guò)高效、低毒農(nóng)藥的交替使用，配合多元組合施藥方式，可提高防治效果。高蓬明等[9]采用噴霧+涂抹+刮除病斑相結(jié)合方法，用72%硫酸鏈霉素等20種殺菌劑對(duì)獼猴桃潰瘍病進(jìn)行室內(nèi)生測(cè)和田間試驗(yàn)，為有效防治獼猴桃潰瘍病提供了依據(jù)。張鋒等[10]采用枝干注射、噴霧、涂抹、灌根等不同組合施藥方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示，噴霧+刮除病斑+涂抹組合的防治效果可達(dá)96%。

近年來(lái)，許多科研人員嘗試用生防菌對(duì)獼猴桃潰瘍病進(jìn)行防治[11-12]。邵寶林等[13]在獼猴桃根部分離得到一株芽孢桿菌B2，用稀釋50倍的發(fā)酵液噴霧，對(duì)該病的防效可達(dá)86.52%。盛存波等[12]用芽孢桿菌B56-3的100倍發(fā)酵稀釋液噴霧，對(duì)潰瘍病的防效在86.5%～91.4%。申哲等[14]利用放線菌gCLA4的發(fā)酵液粗提物稀釋100倍對(duì)獼猴桃潰瘍病的防效達(dá)64.9%。謝俊等[15]在開(kāi)發(fā)防治獼猴桃潰瘍病的木霉菌生物農(nóng)藥劑型時(shí)發(fā)現(xiàn)，與可濕性粉劑相比，油懸浮劑具有滲透性和黏附性強(qiáng)、抗蒸發(fā)、耐雨水沖刷、增效等優(yōu)點(diǎn)。筆者利用2種木霉菌制劑，對(duì)獼猴桃潰瘍病進(jìn)行大田組合施藥防治試驗(yàn)，旨在為生物防治獼猴桃潰瘍病，特別在劑型和使用方法的選擇上提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 木霉菌株。Tr14（T.asperellum）、Tr25（T.koningiopsis）、Tr34（T.virens）、Tr309T（T.viride）、Tr121（T.harzianum）、Tr64（T.atroviride）均由上海萬(wàn)力華生物科技有限公司提供。

1.1.2 病原菌。Pseudomonas syringae pv.actinidiae（PSA）和獼猴桃樹(shù)苗（紅陽(yáng)）均由佳沃（成都）現(xiàn)代農(nóng)業(yè)有限公司提供。

1.1.3 培養(yǎng)基。營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）；

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水 1 000 mL。

1.1.4 供試藥劑。

Tr309T-WP和Tr309T-SC均為上海萬(wàn)力華生物科技有限公司產(chǎn)品；

2%潰腐靈SC為濰坊奧豐作物病毒防治有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 木霉菌株與病原菌（PSA）平板拮抗篩選試驗(yàn)。

1.2.1.1 木霉菌株分生孢子液的制備。用無(wú)菌接種鏟刮取在PDA平板上培養(yǎng)了5 d（28 ℃）的各木霉菌株的分生孢子并轉(zhuǎn)至含10 mL無(wú)菌水的試管中，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，用無(wú)菌水將分生孢子稀釋至2×108個(gè)/mL備用。

1.2.1.2 PSA菌液的制備。用接種針將保存于試管斜面上的PSA在無(wú)菌條件下接種至裝有100 mL NB培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置于18 ℃、180 r/min搖床上培養(yǎng)48 h。吸取1 mL PSA菌液至裝有9 mL無(wú)菌水的試管中，用Petrroff-Hauser計(jì)菌板計(jì)數(shù)，用無(wú)菌水將PSA菌液含菌量稀釋至2×109個(gè)/mL備用。

1.2.1.3 木霉菌分生孢子與PSA混合菌液的制備。用移液槍分別吸取木霉菌分生孢子液（2×108 個(gè)/mL）和PSA菌液（2×109個(gè)/mL）各0.5 mL，加入含9 mL無(wú)菌水的試管中，在振蕩器上搖勻后，取1 mL菌液，按梯度稀釋至 1×10-8個(gè)/mL；分別從1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8個(gè)/mL梯度試管中各取0.2 mL菌液至PDA平板上，均勻涂布，每組3個(gè)重復(fù)。以單個(gè)病原菌和木霉菌株作為空白對(duì)照。在18 ℃下培養(yǎng)5 d后，分別進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)。

1.2.2 田間藥效試驗(yàn)。

1.2.2.1 施藥方法。

試驗(yàn)地點(diǎn)為上海浦東孫橋卉綠農(nóng)場(chǎng)，獼猴桃（紅陽(yáng)）樹(shù)齡為2～3年。

施藥方法：①噴霧施藥。均勻噴霧在葉片正反面及枝干上，間隔7 d施藥1次，共施藥3次，用藥量為500 mL/株。②病斑涂抹施藥。先將病斑刮除干凈，用無(wú)菌棉球蘸取稀釋液對(duì)發(fā)病部位進(jìn)行涂抹，以蘸取無(wú)菌水涂抹作對(duì)照。每處理涂抹50個(gè)病斑，間隔7 d施藥1次，共施藥3次。③灌根施藥。首先灌清水測(cè)算出每株獼猴桃用水量，以保證植物根系土壤濕潤(rùn)為準(zhǔn)，用藥量為1 L/株，間隔7 d施藥1次，共施藥3次。

挑選長(zhǎng)勢(shì)均一的獼猴桃植株，每個(gè)處理10株，3次重復(fù)，隨機(jī)排列。采用針刺接種法[16]對(duì)獼猴桃樹(shù)苗進(jìn)行病原菌接種，接種后用保鮮膜纏繞接種處保濕48 h，后續(xù)采用常規(guī)田間管理。

1.2.2.2 單項(xiàng)施藥試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

單項(xiàng)施藥試驗(yàn)于2015年10—11月進(jìn)行。噴霧和灌根施藥為一組試驗(yàn)，涂抹施藥為獨(dú)立的試驗(yàn)。每個(gè)試驗(yàn)有8個(gè)處理：①Tr309T-WP 125倍；②Tr309T-WP 250倍；③Tr309T-WP 500倍；④Tr309T-SC 125倍；⑤Tr309T-SC 250倍；⑥Tr309T-SC 500倍；⑦2% 潰腐靈SC 100倍；⑧病原對(duì)照。

1.2.2.3 組合施藥試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

組合施藥試驗(yàn)共有7個(gè)處理：①Tr309T-WP 250倍噴霧+涂抹；②Tr309T-WP 250倍噴霧+涂抹+灌根；③Tr309T-SC 250倍噴霧+涂抹；④Tr309T-SC 250倍噴霧+涂抹+灌根；⑤2%潰腐靈SC 100倍噴霧+涂抹；⑥2% 潰腐靈SC 100倍噴霧+涂抹+灌根；⑦病原對(duì)照。

試驗(yàn)在2016年3月 4日第1次施藥，后續(xù)施藥間隔為7 d，共施藥3次；第2年開(kāi)始用藥時(shí)間為2017年3月22日，施藥方法與單項(xiàng)施藥一致。

1.2.2.4 調(diào)查方法。

①噴霧施藥。分別調(diào)查第1次施藥前及末次用藥后7 d的發(fā)病情況，記錄發(fā)病株數(shù)和病情指數(shù)（DS），統(tǒng)計(jì)發(fā)病率及防治效果（ERDC）。

②病斑涂抹施藥。于施藥前掛牌標(biāo)記病斑，末次施藥后7 d調(diào)查復(fù)發(fā)病斑數(shù)，計(jì)算病斑治愈率。③灌根施藥調(diào)查方法與噴霧防治試驗(yàn)相同。

④組合施藥。調(diào)查末次藥后7 d的發(fā)病情況，調(diào)查方法與單項(xiàng)施藥相同，記錄DS，計(jì)算ERDC。

⑤病害分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表 1。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉菌株與PSA平板拮抗篩選結(jié)果

由表2可知，各木霉菌株以及PSA均能在PDA上生長(zhǎng)良好，并在5 d內(nèi)覆蓋整個(gè)平板。在混合涂布的平板上，Tr14、Tr25、Tr34、Tr64、Tr121分別只在稀釋濃度為1×10-5個(gè)/mL的平板上抑制了PSA的生長(zhǎng)，而在稀釋濃度為1×10-6、1×10-7、1×10-8個(gè)/mL的平板上，PSA則抑制了這些木霉菌株的生長(zhǎng)。只有 Tr309T 在稀釋濃度為1×10-8～1×10-5個(gè)/mL的所有平板均抑制了PSA的生長(zhǎng)。因此，選擇Tr309T，將其制成可濕性粉劑與懸浮劑，繼續(xù)在大田進(jìn)行施藥方法和劑型的藥效試驗(yàn)。

2.2 單項(xiàng)施藥試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示（表3、4），噴霧和灌根2種施藥方式下，經(jīng)Tr319-WP 和 Tr319-SC處理的獼猴桃植株的ERCD均隨著施藥量的增加而提高，但均顯著低于2% 潰腐靈SC化學(xué)藥劑處理。在涂抹施藥方式下，經(jīng)Tr319-WP 和 Tr319-SC處理的獼猴桃植株的RRDS均隨著施藥量的增加而提高，但均顯著低于2%潰腐靈SC化學(xué)藥劑處理。

2.3 組合施藥試驗(yàn)結(jié)果

2年組合施藥試驗(yàn)結(jié)果（表5）表明，在組合施藥A方式下，Tr309T-WP、Tr309T-SC、2%潰腐靈處理的DS顯著低于病原對(duì)照處理（2016年：72.84；2017年：80.03）；在組合施藥B方式下，Tr309T-WP和2%潰腐靈SC處理的DS或ERCD都顯著高于或低于Tr309T-SC處理。

3 結(jié)論與討論

針對(duì)獼猴桃潰瘍病的防治，田間管理和化學(xué)藥劑防治是果農(nóng)目前采用的主要手段[16]。較為有效的化學(xué)藥劑有2類，分別是含銅制劑和農(nóng)用鏈霉素類。秦虎強(qiáng)等[17]利用72%農(nóng)用鏈霉素SPX和4%氫氧化銅WG對(duì)獼猴桃潰瘍病進(jìn)行防治，防效分別達(dá)76.6%和73.4%。龍友華等[18]發(fā)現(xiàn)40%硫酸鏈霉素50倍稀釋液對(duì)潰瘍病的田間防效在78.7%以上。然而，含銅制劑常常會(huì)對(duì)獼猴桃葉片造成藥害，而且長(zhǎng)期使用鏈霉素會(huì)使病原菌對(duì)其產(chǎn)生抗藥性[19]。該研究結(jié)果顯示，利用木霉菌制劑對(duì)該病害進(jìn)行防治，不僅在防治效果上與化藥相似，同時(shí)不會(huì)對(duì)植物造成藥害，也不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。謝俊等[15]在開(kāi)發(fā)防治獼猴桃潰瘍病的木霉菌生物制劑時(shí)發(fā)現(xiàn)，與可濕性粉劑相比，油懸浮劑具有滲透性和黏附性強(qiáng)、抗蒸發(fā)、耐雨水沖刷、增效等優(yōu)點(diǎn)。羅秀[20]在防治稻縱卷葉螟研究中發(fā)現(xiàn)，白僵菌可分散油懸浮劑對(duì)卷葉螟的防治效果明顯優(yōu)于蘇云金桿菌可濕性粉劑。該研究采用的組合施藥對(duì)比試驗(yàn)有相似的結(jié)果。經(jīng)木霉菌Tr309T-SC組合施藥A或B 處理的獼猴桃植株，在防治效果上都分別好于經(jīng)木霉菌Tr309T-WP處理的植株。說(shuō)明油懸浮劑能使木霉菌更好地附著在獼猴桃植株上，不易被雨水沖刷，有助于木霉菌在獼猴桃地上部分發(fā)揮藥效。

張鋒等[10]在防治獼猴桃潰瘍病的組合施藥技術(shù)上采用了噴霧+涂抹、噴霧+灌根、灌根+涂抹，并發(fā)現(xiàn)噴霧+涂抹組合的防治效果最佳。該研究在噴霧+涂抹組合的基礎(chǔ)上，增加了灌根處理（組合施藥B），顯著地提高了對(duì)獼猴桃潰瘍病的防治效果。孫虎等[21]、邱德文[22]研究發(fā)現(xiàn)，灌根能將木霉菌接種至作物根部，使其在根際土壤中定殖并改善根際土壤環(huán)境，增強(qiáng)作物長(zhǎng)勢(shì)，并誘導(dǎo)作物對(duì)多種病害產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。Viterbo等[23]通過(guò)灌根，將綠色木霉菌接種到黃瓜幼苗根部，使黃瓜對(duì)細(xì)菌性角斑病產(chǎn)生系統(tǒng)抗性。

為加速綠色農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，環(huán)境友好型的生物農(nóng)藥越來(lái)越受到青睞。許多學(xué)者已對(duì)利用EM菌[24]、芽孢桿菌[11]和放線菌[14]等防治獼猴桃潰瘍病進(jìn)行了多方面的研究。但利用生防真菌防治獼猴桃潰瘍病的研究還鮮有報(bào)道。該研究通過(guò)對(duì)木霉菌株的篩選，對(duì)合適的劑型以及施用方法進(jìn)行了多項(xiàng)測(cè)試，為有效防治獼猴桃潰瘍病提供了依據(jù)。

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