趙慧娟　許梓文

摘要 [目的]研究Lyoflora V3乳桿菌對亞硝酸鹽降解的影響，優(yōu)化其降解條件。[方法]探討了乳酸菌降解亞硝酸鹽的影響因素，主要包括溶液pH、接種量、NaCl含量和培養(yǎng)時間。采用L9（34）正交試驗對整體工藝進行試驗條件優(yōu)化。[結果]影響乳酸菌降解亞硝酸鹽的各因素次序為pH>接種量>NaCl含量>培養(yǎng)時間，最佳降解條件：pH為3.0，接種量為5 %，NaCl含量為9%，培養(yǎng)時間為72 h。在最佳降解條件下，乳酸菌降解亞硝酸鹽的降解率可達98.50%。[結論]該研究可為乳酸菌發(fā)酵工藝中亞硝酸鹽的控制提供參考。

關鍵詞 乳酸菌；亞硝酸鹽；降解； 正交試驗

中圖分類號 TS201.3 文獻標識碼

A 文章編號 0517-6611（2018）17-0176-03

Abstract [Objective]To study the effect of Lactobacillus Lyoflora V3 on nitrite degradation and optimize its degradation conditions.[Method]Factors influencing degradation of nitrite by Lactobacillus were discussed，including pH，inoculation quantity，NaCl content and inocubation time.L9（34）Orthogonal design was adopted to optimize the overall process.[Result]The results show that the order of factors affecting the degradation of nitrite by Lactobacillus is： pH > inoculation quantity>NaCl content>inocubation time.The best conditions were pH 3.0， inoculation quantity 5% ，NaCl content 9%，inocubation time 72 h. Under the best degradation conditions，the degradation rate of lactic acid bacteria can reach 98.50%。[Conclusion]The study can provide a reference for the control of nitrite in the fermentation process of lactic acid bacteria.

Key words Lactic acid bacteria； Nitrite；Degradation；Orthogonal design

亞硝酸鹽是一種潛在的致癌物質，對人體有強的毒害作用，過量攝入易誘發(fā)癌癥。其由于能使食品增色和增加風味，常用作食品添加劑[1-2]。乳酸菌主要分布于礦物質和有機營養(yǎng)物豐富的微酸環(huán)境中，有促進營養(yǎng)分解、吸收的作用，是對人體健康有益的益生菌。有研究表明，乳酸菌在發(fā)酵過程中產生特殊的物質，如酶，可催化亞硝酸鹽的還原，進而具有降解亞硝酸鹽的作用[3-4]。

在此基礎上，筆者對乳酸菌降解亞硝酸鹽的影響因素進行探討，進一步分析了亞硝酸鹽的降解條件，為乳酸菌發(fā)酵工藝中亞硝酸鹽的控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種。Lyoflora V3購自北京多愛特生物科技有限公司。

1.1.2 試劑。

0.1 mol/L HCl、飽和硼砂溶液、亞鐵氰化鉀溶液、乙酸鋅溶液、對氨基苯磺酸溶液、鹽酸萘乙二胺溶液等。

1.1.3 儀器。TU-1901雙光束紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；pHS-3G型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；JA1003B分析天平，上海越平科學儀器有限公司；YXQ-SG41-280電熱手提式壓力蒸汽滅菌器，上海林馨醫(yī)療器材有限公司；SW-CJ-IF型凈化工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；BXD-YX3200臺式電熱恒溫培養(yǎng)箱HHS-21-6電熱恒溫水浴鍋，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.1.4 培養(yǎng)基。

MRS液體培養(yǎng)基：葡萄糖20.0 g，蛋白胨10.0 g，酵母粉4.0 g，磷酸氫二鉀 2.0 g，吐溫80 1.0 mL，乙酸鈉5.0 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 pH對亞硝酸鹽降解的影響。

配制好的MRS液體培養(yǎng)基，加入亞硝酸鈉使?jié)舛葹?00 mg/L，加入7%的NaCl，充分混勻。經121 ℃滅菌15 min后，調pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5，接入4%的經活化2 h后的乳酸菌，于30 ℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)48 h[5]。

1.2.2 接種量對亞硝酸鹽降解的影響。

配制MRS液體培養(yǎng)基，加入亞硝酸鈉使?jié)舛葹?00 mg/L，加入7%的NaCl，充分混勻。經121 ℃滅菌15 min后，調pH為3.0，分別接入1%、2%、3%、4%、5%、6%的菌種，于30 ℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)48 h。

1.2.3 培養(yǎng)時間對亞硝酸鹽降解的影響。

配制MRS液體培養(yǎng)基，加入亞硝酸鈉使?jié)舛葹?00 mg/L，加入7%的NaCl，充分混勻。經121 ℃滅菌15 min后，調pH為3.0，接入4%的經活化2 h后的乳酸菌，于30 ℃、120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)時間分別是0、24、48、72、96、120 h。

1.2.4 NaCl含量對亞硝酸鹽降解的影響。

配制MRS液體培養(yǎng)基，加入亞硝酸鈉使?jié)舛葹?00 mg/L，分別加入1%、3%、5%、7%、9%、11%的NaCl，充分混勻。經121 ℃滅菌15 min后，調pH為3.0，接入4%的經活化2 h后的乳酸菌，于30 ℃ 120 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)48 h。

1.2.5 酵母菌降解亞硝酸鹽正交試驗。

在上述單因素試驗中，每因素篩選出3個水平進行正交試驗。

1.2.6 亞硝酸鹽含量的測定。采用鹽酸萘乙二胺法[4]。

2 結果與分析

2.1 pH對亞硝酸鹽降解的影響 根據(jù)試驗結果，比較出乳酸菌在不同pH時對亞硝酸鹽的降解效果。

從圖1可見，在接種量、NaCl含量和培養(yǎng)時間不變的情況下，改變pH，乳酸菌降解亞硝酸鹽的結果隨之變化。由于酸可以分解亞硝酸鹽[6]，當pH在3.5～4.5時，OD值波動不明顯，而pH小于3.5時變化較為顯著。故pH對亞硝酸鹽降解的影響較大，最佳pH為3.0，故選擇pH為3.0、3.5、4.0進入正交試驗。

2.2 接種量對亞硝酸鹽降解的影響

根據(jù)試驗結果，比較出乳酸菌在不同接種量時對亞硝酸鹽的降解效果。

由圖2可知，當接種量為1%～5%時OD值呈下降趨勢，當OD值大于5%時OD值回升，說明在此段區(qū)域內，接種量為5%結果最佳。這可能是由于接種量過少不利于亞硝酸的降解，接種量過大則會造成培養(yǎng)基的營養(yǎng)不足，影響菌株生物量的增長[7]。所以，采用4%、5%、6%的接種量作為乳酸菌降解亞硝酸鹽的優(yōu)化條件。

2.3 培養(yǎng)時間對亞硝酸鹽降解的影響

根據(jù)試驗結果，比較出乳酸菌在不同培養(yǎng)時間時對亞硝酸鹽的降解效果。

由圖3可知，當培養(yǎng)時間大于48 h后，亞硝酸鹽降解的效率也隨之增大，當混合菌種的培養(yǎng)時間為72 h時，亞硝酸鹽降解的效果最好，這是由于此時處于菌種生長的最適生長期。說明可以通過控制培養(yǎng)時間提高亞硝酸鹽降解的效率，故而選取48、72、96 h進入正交試驗。

2.4 NaCl含量對亞硝酸鹽降解的影響

資料顯示，發(fā)酵初期食鹽有抑制腐敗菌生長的作用，不同鹽濃度對于亞硝酸鹽的降解程度具有很大影響[8]。由圖4可知，當NaCl含量小于9%時，OD值隨鹽濃度的增加先減小，又上升再減小，總體趨勢是減小的，當NaCl含量為9%時，OD值最低，此時亞硝酸鹽降解效果最好，故選擇NaCl含量為7%、9%、11%時進入正交試驗。單因素試驗證明，NaCl含量對乳酸菌降解亞硝酸鹽影響較大。

2.5 乳酸菌降解亞硝酸鹽條件優(yōu)化結果與分析

根據(jù)上述單因素試驗結果，采用L9（34）正交試驗設計方法對整體工藝進行優(yōu)化，結果見表1。

由表1可見，各項影響因素最佳組合為A1B1C2D3，即pH為3.0，接種量為4 %，NaCl含量為11%，時間為72 h。通過OD值比較，最佳組合為A1B2C2D2，兩者不相符，進行驗證試驗。經試驗，最佳組合為A1B2C2D2。此時，OD值為0.008，經計算，亞硝酸鹽降解率為98.50%。

根據(jù)試驗結果分析，各因素對降解效果的影響主次順序為A>B>D>C，即pH>接種量>NaCl含量>培養(yǎng)時間。pH是最大的影響因素，這是由于乳酸可以通過與亞硝酸鹽發(fā)生歧化反應，所以亞硝酸鹽在酸性條件下不穩(wěn)定，可以發(fā)生一定程度的自然降解，從而降低亞硝酸鹽含量。其次是接種量，接種量的大小決定了菌種生長繁殖的速度，在一定范圍內，采用較大的接種量可減少雜菌的生長機會，增強亞硝酸鹽降解的效果。試驗表明，NaCl含量對亞硝酸鹽的降解也有一定影響，這可能是由于Na+與亞硝酸鹽還原酶作用，利用酶催化反應將亞硝酸鹽降解。當培養(yǎng)時間不同時，亞硝酸鹽降解的效果也不相同，菌種在不同生長期的降解效果不同。

3 結論

該試驗初步研究了乳酸菌對亞硝酸鹽降解的效果，通過單因素試驗和正交試驗的方式，以OD值的變化為檢測指標，考察了pH、培養(yǎng)時間、接種量和NaCl含量對亞硝酸鹽降解效果的影響。結果表明，pH為對亞硝酸鹽降解最大的影響因素。在試驗條件范圍內，顯示其影響程度依次排序為pH、接種量、NaCl含量、培養(yǎng)時間。得出的最優(yōu)條件為pH為3.0，接種量為5%，NaCl 含量為9%，時間為72 h。該條件下乳酸菌降解亞硝酸鹽的效果最好。乳酸菌在最佳條件下能夠有效降解亞硝酸鹽，這對于保護環(huán)境以及維護人類健康方面具有重要意義。

參考文獻

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[8] 李文濤.降解亞硝酸鹽乳酸菌的篩選、誘變及復合降解條件優(yōu)化[D].長春：吉林農業(yè)大學，2014.