魏明 師廣勇 劉佳 龔艷杰 陳河濤 梁穎紅 涂玲

450052鄭州大學第五附屬醫(yī)院檢驗科

生存素是凋亡抑制蛋白家族的成員之一，參與細胞周期調(diào)控，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預后密切相關［1?2］。因此，針對生存素的靶向治療有可能最大程度降低對正常組織的損傷，獲得良好的抗腫瘤效果。RNA干擾是一項基因阻斷技術，采用與靶基因同源的小分子干擾RNA（siRNA）轉(zhuǎn)染靶細胞，誘導靶基因mRNA特異性降解，從而抑制目的基因表達，有望成為腫瘤基因治療的新方向。為此，我們將生存素基因序列特異性siRNA轉(zhuǎn)染至皮膚鱗狀細胞癌A431細胞，探討體外轉(zhuǎn)錄siRNA能否有效介導腫瘤細胞出現(xiàn)RNA沉默，進而影響A431細胞增殖和凋亡，探索治療皮膚鱗狀細胞癌靶基因。

一、材料與方法

1.主要試劑及材料：A431細胞來自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。RNA提取試劑Trizol（美國Invitrogen公司），MTT、二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司），改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM）及胎牛血清（美國Gibco公司），細胞侵襲和遷移實驗試劑（美國Corning公司），細胞凋亡試劑和細胞周期檢測試劑（美國BD公司），兔抗人生存素多克隆抗體一抗及內(nèi)參β肌動蛋白抗體、鼠抗兔二抗（北京科瑞生物科技有限公司）。

2.siRNA的設計與合成：通過siRNA分子庫技術，設計并合成15種序列，從中篩選出1種高效生存素siRNA，其正義鏈序列：5′?GCAGATCTTGCTTCGCGATGTACGGGCC?3′，反義鏈序列：5′?CGTCGCGAGGGCTATGAACTAATGACCC?3′；無關序列siRNA的正義鏈：5′?AAGGCUAAGGGGCCGAU GACG?3′，反義鏈：5′?TUUCCGAUUCCCCGGCUACUGC?3′。生存素siRNA、無關序列siRNA均由北京漢博生物技術有限公司合成。本實驗使用前期工作中研究的脂質(zhì)體包裹siRNA，達到傳輸目的。包裹方法采用預制囊泡法，按陽離子脂質(zhì)∶二硬脂酰磷脂酰膽堿∶膽固醇∶聚乙二醇（400）二甲基丙烯酸酯=40∶10∶40∶10（摩爾比）的比例制備成預制囊泡。將50.0 nmol/L生存素siRNA、無關序列siRNA和預制囊泡分別溫浴于35～40℃5 ml乙醇溶液（300 ml/L）中10 min。將生存素siRNA和無關序列siRNA分別加入到預制囊泡中，形成包封生存素siRNA陽性脂質(zhì)體和無關序列siRNA陰性脂質(zhì)體。包封、濃縮，除菌后備用。

3.細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染：用含10%胎牛血清、10 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基于37℃、100%濕度、5%CO2孵箱中單層傳代培養(yǎng)A431細胞。每隔24～48 h更換1次培養(yǎng)基。再將A431細胞鋪于無抗生素的6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h，細胞密度為2×105個/孔。實驗分為生存素siRNA組（用陽性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染）、陰性對照組（用陰性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染）及空白對照組（只加預制囊泡），37℃培養(yǎng)4～6 h后加入含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)需要收集轉(zhuǎn)染后不同時間細胞進行檢測。

4.實時定量反轉(zhuǎn)錄（RT）?PCR檢測生存素mRNA表達水平：收集轉(zhuǎn)染后48 h的A431細胞，提取、純化總RNA，RT?PCR檢測靶基因生存素mRNA表達水平，β肌動蛋白為內(nèi)參。生存素基因：正向引物5′?ACGACCCCATAGAGGAACAT?3′，反向引物5′?TCCGCAGTTTCCTCAAATTC?3′，長度386 bp；β肌動蛋白基因：正向引物5′?GAAGTGAAGGGTCGGAGTC?3′，反向引物5′?GAAGATGGTGATGGGATTTC?3′，長度257 bp。按試劑盒說明書進行操作，采用實時定量RT?PCR檢測，2－△△Ct法計算mRNA相對表達量。

5.Western印跡法檢測A431細胞生存素蛋白表達水平：收集轉(zhuǎn)染后48 h的A431細胞，按照說明書提取總蛋白。取40 μg蛋白質(zhì)進行12%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將產(chǎn)物轉(zhuǎn)至二氟化樹脂膜上，室溫封閉2 h，加入兔抗人生存素，4℃過夜，TBST洗膜，加入鼠抗兔IgG標記辣根過氧化物酶，37℃孵育1 h。加入顯色底物，顯色2 min，曝光后X線片通過HPIAS?1000圖像分析系統(tǒng)半定量分析。

6.MTT法檢測A431細胞增殖：將細胞鋪入96孔板，每孔100 μl，細胞密度為5 × 104個/ml，待細胞貼壁后，按上述分組方法處理，常規(guī)孵育24、48、72、96 h，每孔加入質(zhì)量濃度5 g/L MTT溶液20 μl，培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)液體。每孔加入150 μl DMSO，置搖床上低速振蕩10 min。每組細胞設3個平行孔。酶標儀570 nm波長處測量各孔吸光度（A值），計算細胞增殖抑制率（%），即［1－（A生存素siRNA組－A空白對照組）/（A陰性對照組－A空白對照組）］×100%。

7.流式細胞儀檢測A431細胞周期：將上述轉(zhuǎn)染后48 h的各組細胞消化、離心，用預冷PBS混懸，沖洗2次，加入預冷75%乙醇3 ml，收集細胞，按照說明書用RNA酶處理細胞后，加入碘化丙啶（PI），4℃避光孵育30 min，流式細胞儀檢測A431細胞周期變化。

8.生存素siRNA對A431細胞遷移的影響：按上述方法處理各組細胞，轉(zhuǎn)染后24 h收集細胞，制備單細胞懸液，細胞密度為1×106個/ml。取細胞懸液100 μl放入3個細胞小室，細胞小室的下室加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)10 h后取出細胞小室，PBS浸泡洗滌，用預冷的80%乙醇固定，PBS浸泡洗滌，伊紅染色，PBS快速洗滌。取出小室放入盛有3 ml PBS的6孔板中。倒置熒光顯微鏡下隨機取6個視野計數(shù)（200倍），取平均值。

9.Transwell實驗檢測A431細胞侵襲力：取稀釋的Matrigel膠（40 μl Matrigel+80 μl無血清培養(yǎng)基）30 μl加入細胞小室上室，覆蓋整個聚碳酯膜，37℃30 min后取出培養(yǎng)板，將小室四周多余的稀釋Matrigel膠吸掉，再放入37℃中使Matrigel膠聚合成膠備用。拿出已鋪上Matrigel膠的細胞小室，加入對應分組稀釋后的細胞懸液100 μl；細胞小室的下室加入500 μl 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱24 h后取出固定后并染色。倒置熒光顯微鏡下隨機取6個視野（200倍）計數(shù)細胞。

10.流式細胞儀AnnexinⅤ/PI雙染法檢測細胞凋亡：按上述方法處理各組細胞，每組設3個平行孔。轉(zhuǎn)染后24 h，PBS洗滌，胰酶消化。冷培養(yǎng)基中止消化后移入EP管。1 000×g離心5 min，棄上清液。冷PBS清洗細胞，1 000×g離心5 min，棄上清液。每管加入1×結(jié)合緩沖液200 μl懸浮細胞（細胞密度為1×106個/ml）。避光下每管加入3 μl AnnexinⅤ結(jié)合物FITC，然后再加入2 μl PI，混勻，室溫避光孵育15 min，置于冰上。流式細胞儀檢測細胞凋亡。

11.統(tǒng)計學處理：采用SPSS13.0軟件進行處理。計量資料以±s表示，實驗數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)性檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD?t檢驗，細胞增殖數(shù)據(jù)采用重復測量方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

二、結(jié)果

1.生存素siRNA對A431細胞生存素mRNA及蛋白表達的影響：見表1。生存素siRNA轉(zhuǎn)染后48 h，3組間生存素mRNA及蛋白相對表達量差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.001），而陰性對照組與空白對照組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1、2。生存素siRNA組生存素mRNA顯著低于陰性對照組和空白對照組（LSD?t=12.34、15.36，P=0.002、0.002），見圖1，而生存素蛋白表達亦顯著低于陰性對照組和空白對照組（LSD?t=17.28、21.33，P=0.002、0.001）。

2.生存素siRNA對抑制A431細胞增殖的影響：見圖3。重復測量方差分析顯示，轉(zhuǎn)染生存素siRNA能明顯抑制A431細胞增殖（F=13.19，P=0.004）。組間兩兩比較顯示，生存素siRNA組A431細胞增殖抑制率明顯高于陰性對照組和空白對照組（均P＜0.05），而陰性對照組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。各組A431細胞增殖抑制率有隨時間變化的趨勢（F=23.43，P=0.003）。分組與培養(yǎng)時間因素之間不存在交互作用（F=1.29，P=0.260）。

3.生存素siRNA對A431細胞凋亡的影響：見表1。生存素siRNA組、陰性對照組、空白對照組A431細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002）。生存素siRNA組顯著高于陰性對照組和空白對照組（LSD?t=11.28、10.25，均P＜ 0.05），而陰性對照組與空白對照組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖4。

表1 生存素小分子干擾RNA（siRNA）對A431細胞生存素mRNA及蛋白表達和細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲力的影響（±s）

表1 生存素小分子干擾RNA（siRNA）對A431細胞生存素mRNA及蛋白表達和細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲力的影響（±s）

注：n=3

組別生存素siRNA組陰性對照組空白對照組F值P值生存素mRNA 0.56±0.15 0.88±0.37 0.90±0.43 276.67＜0.001生存素蛋白0.59±0.04 0.86±0.05 0.91±0.07 243.61＜0.001細胞凋亡率（%）21.45±2.39 8.91±1.34 9.22±1.48 83.97 0.002 G2/M期細胞比例（%）17.38±3.68 7.75±1.45 5.26±2.12 65.29 0.002細胞遷移數(shù)39.96±6.83 83.14±7.68 85.26±9.20 368.48＜0.01細胞侵襲數(shù)24.67±5.94 46.23±6.37 48.26±7.45 296.34＜0.01

4.生存素siRNA對A431細胞周期的影響：見表1。轉(zhuǎn)染生存素siRNA后48 h，A431細胞周期發(fā)生明顯變化，3組間G2/M期細胞比例差異有統(tǒng)計學意義（F=65.29，P=0.002）。生存素siRNA組G2/M期細胞比例高于陰性對照組和空白對照組（LSD?t=9.47、11.92，均P＜ 0.05），而陰性對照組與空白對照組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見圖5。

5.生存素siRNA對A431細胞遷移及侵襲能力的影響：見表1。3組間A431細胞遷移數(shù)及侵襲數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01）。兩兩多重比較顯示，轉(zhuǎn)染生存素siRNA后，其A431細胞遷移數(shù)及侵襲數(shù)均明顯低于空白對照組和陰性對照組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。而陰性對照組細胞遷移數(shù)和侵襲數(shù)與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

三、討論

近來，基因療法的應用逐漸成為皮膚鱗狀細胞癌的研究熱點，并取得一系列進展［3?5］。生存素具有抑制細胞凋亡和調(diào)節(jié)細胞有絲分裂的功能，是聯(lián)系細胞周期和細胞凋亡界面的重要因子。該基因幾乎在所有種類的腫瘤組織中有表達，而正常組織幾乎不表達［6?7］。生存素在腫瘤細胞中高表達后，不但抑制腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤細胞有絲分裂，還參與血管形成和放化療耐受等多種功能。因此，針對生存素基因的腫瘤靶向治療受到國內(nèi)外學者的廣泛關注［8?10］。

本研究通過轉(zhuǎn)染生存素siRNA調(diào)控A431生存素蛋白和mRNA表達以及細胞增殖和凋亡，結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染后48 h生存素mRNA和蛋白表達均下調(diào)，轉(zhuǎn)染后24 h細胞凋亡率增加，且細胞增殖抑制率隨培養(yǎng)時間延長而逐漸增加。提示RNA干擾在體外能成功沉默A431細胞的生存素基因，抑制A431細胞增殖，促進細胞凋亡。陳思遠等［11］在黑素瘤細胞株A375中也觀察到相似的變化，證實生存素具有抑制凋亡和調(diào)節(jié)細胞增殖的作用。此外，有研究表明［12?13］，生存素能特異性表達于細胞周期的G2/M期，它與有絲分裂紡錘體微管結(jié)合，使腫瘤細胞免遭凋亡并順利通過G2/M期完成異常有絲分裂，而微管中半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase?3）和Caspase?7處于抑制狀態(tài)，這可能是生存素對G2/M期凋亡抑制的機制之一。

皮膚鱗狀細胞癌的侵襲和轉(zhuǎn)移是主要的致死因素。本研究顯示，從基因水平抑制生存素的表達可以有效抑制A431細胞穿越基質(zhì)膠處理過的Transwell小室的能力，提示抑制生存素的表達可以使A431細胞穿膜侵襲活力下降，表明生存素在腫瘤細胞的侵襲行為中可能起重要作用。

總之，體外小分子干擾生存素基因可以抑制A431細胞生存素的表達，從而影響細胞增殖和凋亡，但對生存素參與鱗狀細胞癌形成的具體機制仍需進一步研究。

圖1 生存素siRNA對A431細胞生存素mRNA表達的影響M：DNA標記物；1：空白對照組；2：陰性對照組；3：生存素siRNA組

圖2 生存素siRNA對A431細胞生存素蛋白表達的影響 1：空白對照組；2：陰性對照組；3：生存素siRNA組

圖3 生存素siRNA對A431細胞增殖的影響 空白對照組細胞增殖抑制率處于較低水平，且基本不隨時間增加；陰性對照組細胞增殖抑制率略高于空白對照組，隨時間緩慢增加；生存素siRNA組A431細胞增殖抑制率隨時間逐漸升高，72 h后仍明顯高于陰性對照組和空白對照組

圖4 生存素siRNA對A431細胞凋亡的影響 4A：空白對照組；4B：陰性對照組；4C：生存素siRNA組。B2區(qū)為凋亡細胞，其凋亡細胞明顯多于空白對照組和陰性對照組 圖5生存素siRNA對A431細胞周期的影響 5A：空白對照組；5B：陰性對照組；5C：生存素siRNA組。生存素siRNA組G2/M期細胞比例明顯高于陰性對照組和空白對照組

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