劉衛(wèi)民，柳學(xué)芳，龔文端

潛江市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北潛江4331000

微小RNA（microRNA，miRNA）廣泛存在于真核生物中，對生物體的影響較大[1-2]。在癌細(xì)胞的生長過程中，miRNA通過影響癌細(xì)胞生長相關(guān)基因的表達(dá)，參與癌細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移[3]。人類miRNA-27家族成員包括miRNA-27a和miRNA-27b，與其他miRNA形成miRNA簇[4]。miRNA與多種腫瘤進(jìn)程密切相關(guān)，如乳腺癌、食管癌、胰腺癌、肝癌等[5-8]。目前，尚未有miRNA-27對人卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲能力影響的研究。SPRY2是生物體內(nèi)的一種抑癌基因，在抑制細(xì)胞增殖、分化及遷移等生物學(xué)效應(yīng)中發(fā)揮重要作用[9]。Wnt/β-catenin信號通路已被證實(shí)參與癌細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程[10]。因此，推測SPRY2作為一種抑癌基因，可能影響Wnt/β-catenin信號通路的傳導(dǎo)，抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。本研究探討了miRNA-27a對卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響，旨在為卵巢癌的臨床治療中引入miRNA干預(yù)的方法提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本采集與分組

收集2014年12月至2016年6月于潛江市中心醫(yī)院行卵巢癌切除手術(shù)的112例卵巢癌患者的腫瘤標(biāo)本，保留卵巢癌組織及癌旁正常上皮結(jié)締組織（組織正常對照），液氮凍存。所有腫瘤標(biāo)本均經(jīng)術(shù)后病理組織學(xué)分析確認(rèn)。樣本收集已得到本院倫理委員會的批準(zhǔn)，患者已知情同意并簽署知情同意書。人卵巢癌細(xì)胞系HO-8910從中國科學(xué)院細(xì)胞庫獲?。?xì)胞正常對照為正常卵巢上皮細(xì)胞）。將HO-8910細(xì)胞分為5組：A組，細(xì)胞未進(jìn)行轉(zhuǎn)染；B組，細(xì)胞轉(zhuǎn)染control inhibitor；C組，細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-27a inhibitor；D組，細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-27a inhibitor和si-SPRY2；E組，細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA-27a inhibitor和si-NC。組織標(biāo)本用于檢測miRNA-27a和SPRY2表達(dá)水平；人卵巢癌HO-8910細(xì)胞和正常對照細(xì)胞用于檢測miRNA-27a和SPRY2表達(dá)水平及檢測細(xì)胞增殖、侵襲和活性等變化。

1.2 質(zhì)粒構(gòu)建

采用PCR擴(kuò)增的方法獲得人類SPRY2基因的3′-UTR序列?；厥誔CR產(chǎn)物后構(gòu)建pGL3-WTSPRY2-3′-UTR質(zhì)粒（WT-SPRY2）和對照pGL3-MUTSPRY2-3′-UTR質(zhì)粒（MUT-SPRY2）。miRNA-27a inhibitor和control inhibitor購自上海GenePharma公司，si-SPRY2和si-NC購自美國Invitrogen公司。

1.3 熒光定量RT-PCR

細(xì)胞培養(yǎng)72 h后，PBS清洗3次，提取總RNA。組織標(biāo)本于液氮中研磨，提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄采用PrimeScriptTMRT reagent kit試劑盒（Takara公司）進(jìn)行操作。PCR體系如下：cDNA溶液1.6 μl，2×STBR GREEN Taq PCR MIX 5 μl，PCR上下游引物（10μmol/L）各0.2 μl，DDW 3 μl。PCR反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃ 10 s，58℃ 10 s，72℃10 s，共60個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。內(nèi)參基因?yàn)棣?actin。引物序列詳見表1。

表1 熒光定量RT-PCR的引物序列

1.4 Western blot

細(xì)胞培養(yǎng)24 h并清洗，加入RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑勻漿，4℃環(huán)境中，12 000g離心10 min，取上清，BCA法檢測蛋白濃度，-80℃保存。取出液氮凍存組織，裂解及蛋白酶抑制劑勻漿與細(xì)胞操作類似。Western blot使用10%SDS-PAGE Gel。每孔加入蛋白樣品20 μg。一抗使用rabbit polyclonal anti-SPRY 2，二抗使用POD-conjugated goat anti-rabbit（1∶5000），室溫30 min。加入HRP顯色。內(nèi)參使用β-actin。

1.5 熒光素酶分析

熒光素酶分析時將HO-8910細(xì)胞分為4組：F組（野生型），細(xì)胞轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-SPRY2和miRNA-27a inhibitor；G組（野生型），細(xì)胞轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-SPRY2和control inhibitor；H組（突變型），細(xì)胞轉(zhuǎn)染MUTSPRY2和miRNA-27a inhibitor；I組（突變型），細(xì)胞轉(zhuǎn)染MUT-SPRY2和control inhibitor。轉(zhuǎn)染采用lipofectamine RNAiMax Kit。48 h 后，采用Dual-Luciferase Reporter Assay System（美國Promega公司）分析熒光素酶活性。

1.6 MTT法檢測細(xì)胞增殖情況

在96孔板中分別培養(yǎng)A、B、C、D、E組HO-8910細(xì)胞，密度為每孔1×105個細(xì)胞。每組設(shè)4個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μl MTT溶液，孵育4 h，棄上清，加入100 μl DMSO振蕩。酶標(biāo)儀檢測570 nm處吸光度值。在24、48、72、96 h共4個時間點(diǎn)采用Vybrant?MTT Cell Proliferation Assay Kit檢測細(xì)胞增殖情況。

1.7 細(xì)胞侵襲能力分析

用matrigel包被Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)濾波器上表面，將600 μl腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液加入chamber底部，將含有5×104個腫瘤細(xì)胞的無血清培養(yǎng)基加入其頂部。培養(yǎng)24 h后，吸去無血清培養(yǎng)基，刮去上表面的貼壁細(xì)胞，100%甲醇固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色。對3個隨機(jī)視野內(nèi)侵入matrigel的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.8 免疫熒光染色

在6孔板中放置0.1%gelatin包被的蓋玻片，加入細(xì)胞使細(xì)胞培養(yǎng)密度達(dá)到80%～90%，將培養(yǎng)液吸去，PBST清洗3次，4%多聚甲醛固定20 min，含10%山羊血清的PBST室溫封閉1 h，加入一抗兔多克隆抗β-catenin，二抗FITC偶聯(lián)山羊抗兔抗體，同時加入DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，室溫30 min，PBS清洗3次，倒置于載玻片上。使用共聚焦顯微鏡（Radiance 2100 Contocal，美國Bio-Rad公司）觀測。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用重復(fù)測量單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織標(biāo)本及HO-8910細(xì)胞中miRNA-27 a、SPRY 2表達(dá)水平的檢測

熒光定量RT-PCR和Western blot法檢測結(jié)果顯示：卵巢癌組織中miRNA-27a的表達(dá)水平較癌旁正常上皮結(jié)締組織上升[（2.33±0.25）vs（1.01±0.17）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=46.21，P＜0.01）；而卵巢癌組織中SPRY2的mRNA[（0.47±0.14）vs（0.97±0.19）]和蛋白[（0.51±0.09）vs（0.98±0.19）]表達(dá)水平均較癌旁正常上皮結(jié)締組織下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=22.42、23.66，P＜0.01），詳見圖1。HO-8910細(xì)胞中miRNA-27a的表達(dá)水平高于正常卵巢上皮細(xì)胞[（1.98±0.16）vs（1.01±0.28）]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.512，P＜0.01）；而HO-8910細(xì)胞中SPRY2的mRNA[（0.49±0.13）vs（0.96±0.20）]和蛋白[（0.52±0.05）vs（0.99±0.18）]水平均低于正常卵巢上皮細(xì)胞，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.231、7.956，P＜0.01），詳見圖2。

圖1 卵巢癌組織與癌旁正常上皮結(jié)締組織中miRNA-27 a、SPRY 2表達(dá)水平的比較

圖2 HO-8910細(xì)胞與正常卵巢上皮細(xì)胞中miRNA-27 a、SPRY 2表達(dá)水平的比較

2.2 HO-8910細(xì)胞增殖情況

培養(yǎng)24、48、72、96 h四個時間點(diǎn)，C組HO-8910細(xì)胞的增殖率低于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=399.4，P＜0.01）；而D組HO-8910細(xì)胞的增殖率與B組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.141，P＞0.05）。E組HO-8910細(xì)胞的增殖率低于B組和D組，三組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=223.2，P＜0.01）。（圖 3）

圖3 MTT法檢測HO-8910細(xì)胞增殖情況

2.3 熒光素酶檢測HO-8910細(xì)胞中miRNA-27 a與SPRY 2的關(guān)系

HO-8910細(xì)胞轉(zhuǎn)染后進(jìn)行熒光素酶檢測，檢測結(jié)果顯示：以G組HO-8910細(xì)胞的熒光素酶活性為1，H組和I組HO-8910細(xì)胞的熒光素酶活性比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.497，P＜0.01）；F組HO-8910細(xì)胞的熒光素酶活性明顯高于G組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.648，P＜0.01）。（圖4）

圖4 HO-8910細(xì)胞中熒光素酶活性分析結(jié)果

2.4 HO-8910細(xì)胞侵襲情況

C組HO-8910細(xì)胞的侵襲數(shù)量少于B組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；D組HO-8910細(xì)胞的侵襲數(shù)量與B組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；E組HO-8910細(xì)胞的侵襲數(shù)量少于B組和D組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖5）

2.5 HO-8910細(xì)胞中miRNA-27 a與Wnt/ β-catenin信號通路的關(guān)系

A組和B組的HO-8910細(xì)胞中，β-catenin沒有進(jìn)入細(xì)胞核；D組的HO-8910細(xì)胞中，β-catenin表達(dá)無明顯上升，而且也沒有進(jìn)入細(xì)胞核；C組的HO-8910細(xì)胞中，β-catenin表達(dá)上升，且進(jìn)入細(xì)胞核；E組的HO-8910細(xì)胞中，β-catenin表達(dá)上升，且進(jìn)入細(xì)胞核。（圖6）

3 討論

圖5 HO-8910細(xì)胞侵襲情況（結(jié)晶紫染色，×100）

圖6 HO-8910細(xì)胞中Wnt/β -catenin信號通路分析結(jié)果（免疫熒光染色，×200）

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，其病死率居?jì)D科惡性腫瘤的第1位[11]。本研究結(jié)果證明miRNA-27a能夠通過靶向抑制SPRY2的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路，從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。miRNA-27a可以參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，并起到一定的促進(jìn)或抑制作用，SPRY2能夠抑制腫瘤的發(fā)生，Wnt信號通路廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中，是一類在物種進(jìn)化中高度保守的信號通路，在動物胚胎的早期發(fā)育、器官形成、組織再生和其他生理過程中，具有至關(guān)重要的作用。如果Wnt信號通路中的關(guān)鍵蛋白發(fā)生突變，導(dǎo)致信號異?；罨?，就可能誘導(dǎo)癌癥的發(fā)生[12]。Wnt信號一旦失活，腺瘤息肉病復(fù)合物磷酸化β-catenin，導(dǎo)致β-catenin降解，從而阻止β-catenin的核內(nèi)沉積，使轉(zhuǎn)錄因子（TCF）不被激活，最終導(dǎo)致靶基因不能轉(zhuǎn)錄和翻譯成蛋白質(zhì)。

在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中，一般包含了多種復(fù)雜的病理變化，對細(xì)胞的生長和分化產(chǎn)生影響[13]。HO-8910細(xì)胞的增殖能力相對癌旁正常組織細(xì)胞的增殖能力明顯加強(qiáng)，并且信號通路紊亂，使得細(xì)胞無節(jié)制地增殖發(fā)展為腫瘤。miRNA-27a通過抑制SPRY2促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的侵襲能力，腫瘤細(xì)胞除無節(jié)制的增殖外還會表現(xiàn)為侵襲其余組織和器官，即腫瘤細(xì)胞在無限增殖的過程中會發(fā)生轉(zhuǎn)移，這其中也會受到多條信號通路的影響，Wnt/β-catenin信號通路均參與了腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲這兩個病理過程[14]。SPRY2是一種抑癌基因，能夠抑制卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展，當(dāng)人體中的miRNA-27a出現(xiàn)異常時，miRNA-27a會抑制SPRY2的表達(dá)，SPRY2表達(dá)下調(diào)激活了Wnt/β-catenin信號通路，從而促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲，這可能是因?yàn)镾PRY2表達(dá)下調(diào)激活了與Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)的激酶。綜上所述，本文研究發(fā)現(xiàn)miRNA-27a通過靶向抑制SPRY2激活Wnt/β-catenin信號通路，從而促進(jìn)人卵巢癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，miRNA-27a在卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響方面起到很大的作用，由此可以進(jìn)一步推測在卵巢癌的臨床治療中可以引入miRNA干預(yù)治療的方法，對卵巢癌的預(yù)防及治療方面具有一定的意義。

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