陳海云,吳濤,周筑,白平,李紅,張學(xué)星

(云南省林業(yè)科學(xué)院，云南 昆明650201)

美麗馬醉木(Pierisformosa)為杜鵑花科(Ericaceae)馬醉木屬(Pieris)常綠灌木或小喬木，生于海拔1 500-2 800m的常綠闊葉林下、松林或林緣灌叢中，其株形優(yōu)美，葉色多彩，花序絢麗多姿，十分迷人。在歐洲、日本廣泛用于室內(nèi)盆栽和小庭院觀賞。此物種耐寒、抗風(fēng)、抗污染，萌發(fā)力強(qiáng)，為園林綠化極佳的觀葉性常綠灌木，目前正被引種馴化并在園林綠化中進(jìn)行推廣應(yīng)用[1-3]。隨著人們欣賞水平的提高，如何選育出葉型、色彩等異質(zhì)類型(品種)，以滿足園林綠化市場需求，將是園林植物選育的發(fā)展趨勢。因此，開展美麗馬醉木種質(zhì)資源的遺傳多樣性研究，將有助于美麗馬醉木特異種質(zhì)資源的選擇和定向培育。

分子標(biāo)記是種質(zhì)資源和遺傳育種研究中一種有效的研究方法和輔助育種手段。利用分子標(biāo)記技術(shù)研究物種的遺傳多樣性、確定親緣關(guān)系遠(yuǎn)近及鑒定品種等工作已相當(dāng)成熟，目前得到廣泛應(yīng)用[4-5]。隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(Randomly amplified polymorphic DNA，RAPD)分子標(biāo)記手段是種質(zhì)資源和遺傳育種研究中一個(gè)簡便而有效的工具，其技術(shù)程序簡單快捷，且無需事先知曉基因(組)核酸序列信息，無種屬特異性，有海量的引物可供利用，能產(chǎn)生足夠的多態(tài)性，可以鑒別物種之間和種群之間的基因組差異，也可區(qū)分個(gè)體之間的差異[6-8]。美麗馬醉木DNA水平的遺傳多樣性研究尚未見報(bào)道，鑒于其核酸序列信息匱乏的現(xiàn)狀，本項(xiàng)研究旨在應(yīng)用無需進(jìn)行引物設(shè)計(jì)的RAPD方法，通過對(duì)美麗馬醉木混合種源實(shí)生播種的不同單株個(gè)體間的RAPD分析，以期獲得穩(wěn)定高效的引物系列，了解其物種水平上的遺傳多樣性水平，為進(jìn)一步人工雜交育種和新品種選育提供分子標(biāo)記方面的數(shù)據(jù)和技術(shù)方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為64棵美麗馬醉木的單株葉樣，其來源于云南楚雄、蘭坪、師宗等地采集的混合種子并于云南省楚雄州祿豐縣仁興鎮(zhèn)大平壩基地所培育的實(shí)生播種苗，株齡為3年生。2016年11月采集其生長正常、無病蟲害的當(dāng)年生枝條上的葉片，置于采樣袋中帶回實(shí)驗(yàn)室。供試材料的葉片大小、葉色及花序顏色等具體信息見表1。

表1 64份美麗馬醉木樣品的基本信息Tab.1 Sample information of 64 individuals in Pieris formosa

1.2 研究方法

1.2.1 總DNA制備

采用植物基因組DNA提取試劑盒(天更公司生產(chǎn))進(jìn)行美麗馬醉木葉片中的總DNA提取。稱取0.1g鮮葉樣品，置于1.5mL離心管中，加入直徑為5mm鋼珠，液氮冷凍后用球磨儀振蕩研磨1.5min；在離心管中加入400μL緩沖液LP1和5μL的RNaseA，旋渦震蕩1min，室溫靜置10min；加入130μL的緩沖液LP2，充分混勻，旋渦震蕩1min；12 000rpm離心5min，將上清液移至新的離心管中；加入900μL的緩沖液LP3，充分震蕩混勻15s；將所得溶液加入吸附柱中后過濾并舍棄；加入600μL的漂洗液PW對(duì)吸附柱進(jìn)行漂洗，12 000rpm離心30s，倒掉廢液，漂洗2次；將吸附柱放回收集管中，12 000rpm離心2min，倒掉廢液，將吸附柱置于室溫或超凈工作臺(tái)放置30min，以徹底晾干吸附柱中殘余的漂洗液；將吸附柱加入1個(gè)干凈的離心管中，向吸附柱中間位置懸空滴加80μL的洗脫緩沖液TE，室溫放置5min，12 000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中。取3μL經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，稀釋成濃度為20ng/μL的工作液，放入-20℃冰箱保存。

1.2.2 RAPD引物篩選

RAPD引物由生工(北京)合成。用Biometra PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳，以D2000為標(biāo)記，EB染色10min，用百晶凝膠成像儀進(jìn)行拍照和分析。RAPD引物分別為A、B、C、D、E、F、G、H、M、N共10套，每套20條，共200條。隨機(jī)挑選8份樣品的DNA，分別取30μL混合為引物篩選所用的DNA模板。首先用混合DNA模板對(duì)200條RAPD引物進(jìn)行篩選，選出擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定、條帶清晰的引物；然后隨機(jī)選取12個(gè)樣品單株的DNA，檢測初篩出的引物的多態(tài)性，以具有多態(tài)性的引物用于后續(xù)64份樣品的遺傳多樣性分析。

1.2.3 PCR反應(yīng)體系及程序

20μL的PCR反應(yīng)體系中，含10μL的2×Es Taq MasterMix(康為世紀(jì)，含染料)，9μL的引物(5μmol/L)，1μL的DNA模板。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min；94℃變性30s，40℃退火30s，72℃延伸30s，10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度下降1℃；94℃變性30s，40℃退火30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72℃完全延伸5min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上電泳分離，經(jīng)溴化乙錠(EB)染色，通過凝膠成像儀(百晶)拍攝圖像并保存。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)RAPD-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜同一位置上條帶的有無進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有帶(包括弱帶)的記為“1”，無帶的記為“0”，得到所有位點(diǎn)的二元數(shù)據(jù)構(gòu)成的數(shù)據(jù)矩陣用于分析。采用POPGENE 1.32軟件[9]分析遺傳變異各項(xiàng)參數(shù)，包括美麗馬醉木物種水平的多態(tài)位百分率(PPB)、Shannon多樣性信息指數(shù)(I)、Nei’S基因多樣度指數(shù)(H)、平均每個(gè)位點(diǎn)上的觀察等位基因數(shù)(Na)、平均每個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)(Ne)。根據(jù)64個(gè)樣本間的遺傳相似性系數(shù)，用NTSYSpc-2.11e軟件，按不加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法(UPGMA)建立親緣關(guān)系聚類分枝樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD引物篩選結(jié)果

共選用200條RAPD隨機(jī)引物，用混合DNA模板初篩后獲得擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定、產(chǎn)物條帶清晰的引物47條。圖1展示了混合DNA模板對(duì)24條引物的RAPD-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果；經(jīng)12份樣品的DNA模板復(fù)篩后，其中16條引物具有多態(tài)性(表2)，用于后續(xù)64份美麗馬醉木樣品的PCR擴(kuò)增和分析。圖2展示了引物A19對(duì)30份美麗馬醉木樣品的RAPD-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果。

圖1 混合DNA模板對(duì)24條引物的RAPD-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 RAPD-PCR patterns of 24 primers in mixed DNA template

圖2 引物A19對(duì)部分美麗馬醉木樣品的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results of PCR products from 30 individuals of Pieris formosa with primer A19

2.2 RAPD-PCR擴(kuò)增條帶的多態(tài)性分析

利用篩選出的16條RAPD引物對(duì)美麗馬醉木64份單株樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得片段大小在150-2 100bp，每個(gè)引物的擴(kuò)增條帶數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)見表2。擴(kuò)增條帶總數(shù)為221條，其中多態(tài)性位點(diǎn)192個(gè)，平均每個(gè)引物可擴(kuò)增13.8條帶，其中多態(tài)性帶平均為12.0條。多態(tài)性位點(diǎn)百分率(PPB)為86.88%。其中，引物A11、A19、B10、N10所獲得的條帶均為多態(tài)性條帶，多態(tài)性比例為100%；引物N09所獲得的條帶多態(tài)性比例最低，為63.64%；引物A11、N10所獲得的總條帶數(shù)最多，均為18條帶；引物B15獲得的總條帶數(shù)最少，為7條。

2.3 美麗馬醉木的遺傳多樣性和樣品間的聚類

分析

美麗馬醉木大、中、小葉型資源間，中葉型資源的多態(tài)性位點(diǎn)百分率(PPB)最高(68.33%)，其次為大葉(59.73%)，小葉資源的PPB最低(42.53%)。在物種水平上，多態(tài)性位點(diǎn)百分率(PPB)為86.88%，平均每個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)(Ne)為1.434 2，Nei’s基因多樣度(H)為0.259 1，總的基因多樣度(Ht)為0.256 6，Shannon’s信息指數(shù)(I)為0.395 4，大、中、小葉型資源間的基因流(Nm)為1.315 5。

表2 RAPD引物信息及其擴(kuò)增結(jié)果Tab.2 The summary of RAPD primer sequences and their amplification results

表3 RAPD標(biāo)記的大、中、小葉美麗馬醉木資源的遺傳多樣性參數(shù)Tab.3 Statistical analysis of genetic variation by RAPD markers from big,middle and small leaf-type individuals in Pieris formosa

供試樣品個(gè)體間RAPD片段的共享性(即遺傳一致度或遺傳相似系數(shù))能夠在一定程度上反映個(gè)體間DNA水平的差異，根據(jù)16條引物在64個(gè)樣品中的擴(kuò)增結(jié)果，算出各樣品間的遺傳相似系數(shù)，結(jié)果表明，64個(gè)美麗馬醉木樣品間的遺傳相似系數(shù)為0.36-0.92，平均為0.64。其中，27號(hào)和28號(hào)均為大葉樣本，兩者之間的遺傳相似系數(shù)最大，表明其在64份資源之間的親緣關(guān)系最近；26號(hào)(大葉)和52號(hào)(小葉)之間的遺傳相似系數(shù)最小，表明其在64份資源之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。應(yīng)用NTSYSpc-2.11e軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)矩陣分析后獲得相似系數(shù)矩陣，用UPGMA法進(jìn)行遺傳相似性聚類分析，得到美麗馬醉木64份供試樣本的遺傳相似性聚類分析樹狀圖(圖3)。

供試材料中，1-34號(hào)樣本全部為大葉片，35-54號(hào)為中葉片，55-64號(hào)為小葉片。從聚類圖中可以看出，供試樣本的相似系數(shù)在0.36-0.92之間。當(dāng)相似系數(shù)的閾值為0.36時(shí)，可將64個(gè)供試樣本分為2個(gè)類群：一個(gè)類群(簡稱類群1)包含1-34號(hào)的全部樣本，即大葉片的樣本全部分在一個(gè)類群里；另一個(gè)類群(簡稱類群2)包含35-64號(hào)的全部樣本，即中葉片和小葉片的樣本全部分在一個(gè)類群里。當(dāng)閾值為0.58時(shí)，可將類群1分為2個(gè)組(標(biāo)記為Ⅰ和Ⅱ)，其中Ⅱ組里只包含樣本16號(hào)。類群2分為3個(gè)組(分別標(biāo)記為Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)，其中Ⅳ組里只包含樣本51號(hào)；Ⅲ組里包含中葉片的35-50號(hào)；Ⅴ組里包含全部小葉片供試樣本55-64號(hào)，另外還包含中葉片的52號(hào)、53號(hào)和54號(hào)。

圖3 美麗馬醉木64份樣品的遺傳相似性系數(shù)的聚類結(jié)果Fig.3 Dendrogram of 64 individuals in Pieris formosa based genetic similarity coefficient

3 結(jié)論與討論

運(yùn)用DNA分子標(biāo)記技術(shù)在內(nèi)的分子生物學(xué)方法探討動(dòng)植物的遺傳多樣性，在近20年來已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用[10]。由于RAPD技術(shù)具有可供選擇的標(biāo)記數(shù)量多、無器官和發(fā)育時(shí)期的特異性，可客觀地揭示實(shí)驗(yàn)材料之間的真實(shí)差異等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于生物的系統(tǒng)進(jìn)化研究[11]。汪小全等[12]認(rèn)為，在屬、種內(nèi)和群體內(nèi)，特定大小的RAPD片段具有序列同源和遺傳相似性的假設(shè)是普遍有效的，RAPD技術(shù)在植物種屬間關(guān)系的研究方面也顯示出一定的潛力。劉春林等[13]認(rèn)為，為了增加實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，從DNA提取到RAPD-PCR的擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)盡量是同一個(gè)人員來操作，并且對(duì)實(shí)驗(yàn)過程采用同一反應(yīng)條件并不斷進(jìn)行重復(fù)，直至結(jié)果穩(wěn)定。

研究篩選得到的16條引物中，引物A11、B10、N10的擴(kuò)增條帶分別為18條、16條和18條，且多態(tài)性較好，這說明研究材料具有較高的遺傳多樣性和豐富的遺傳基礎(chǔ)，也表明這3個(gè)引物的篩選效率較高。黃雯等[14]在枳椇(Hoveniaacerba)種質(zhì)資源的RAPD研究中也獲得類似結(jié)果。在物種水平上，美麗馬醉木的多態(tài)性位點(diǎn)百分率(PPB)為86.88%，與杜鵑花科的大字杜鵑(Rhododendronschlippenbachin，PPB=86.93%)[15]相近，高于都支杜鵑(R.shanii，PPB=52.17%)[16]和牛皮杜鵑(R.chrysanthum，PPB=42.7%)[17]，說明美麗馬醉木和杜鵑花科杜鵑屬的其它物種的遺傳多樣性的豐富程度相當(dāng)。

從聚類結(jié)果可以看出，供試樣本中的大葉片與小葉片之間的遺傳相似系數(shù)最小，即親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；供試樣本中的中葉片與小葉片之間的遺傳相似系數(shù)最大，即親緣關(guān)系最近；大葉片和中、小葉片的樣本分別聚在不同的類群中，說明它們不僅表型上存在著較大的差異，基因組水平上也可檢測出較大的差異。供試樣本的遺傳相似系數(shù)在0.36-0.92之間，說明美麗馬醉木的遺傳基礎(chǔ)較為豐富，具有較為豐富的遺傳變異，從而進(jìn)一步佐證了按照表型對(duì)美麗馬醉木種質(zhì)資源進(jìn)行分類的可行性以及用RAPD技術(shù)鑒別美麗馬醉木植物親緣關(guān)系的可行性。楊向暉等[18]對(duì)枇杷屬(Eriobotrya)植物及其近緣屬植物親緣關(guān)系的RAPD分析結(jié)果也與傳統(tǒng)的形態(tài)分類學(xué)基本一致。

美麗馬醉木是一種優(yōu)良的觀葉植物，在云南省有著較為廣泛的分布。為了達(dá)到更佳的園林景觀效果，需要對(duì)美麗馬醉木的不同類型進(jìn)行篩選，選出景觀效果更佳、品種特性更加穩(wěn)定的優(yōu)良特異種質(zhì)。項(xiàng)目組先從表型上對(duì)美麗馬醉木表現(xiàn)出來的優(yōu)異特性進(jìn)行觀測和分析，用葉片的大小把美麗馬醉木分為3種類型，又通過RAPD-PCR技術(shù)對(duì)基因組的總DNA水平進(jìn)行檢測分析，研究結(jié)果說明美麗馬醉木的遺傳基礎(chǔ)較為豐富，有著豐富的遺傳變異，能夠?yàn)閳@林生產(chǎn)上提供更多的優(yōu)異種質(zhì)和選擇方向。本次實(shí)驗(yàn)采用RAPD技術(shù)，首次用16條引物對(duì)混合種源播種的64個(gè)美麗馬醉木樣本進(jìn)行了基因組DNA水平上的檢測，共獲得了192條多態(tài)性條帶，多態(tài)性百分率達(dá)86.88%，說明美麗馬醉木的供試樣本之間遺傳基礎(chǔ)較廣，具有豐富的遺傳多樣性。遺傳相似性聚類結(jié)果可將大葉片和中、小葉片兩種類型的美麗馬醉木樣本劃分為2個(gè)不同的類群。通過對(duì)美麗馬醉木混合種源實(shí)生苗的遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系的確立，有望為進(jìn)一步優(yōu)異種質(zhì)選育工作提供理論依據(jù)。

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