薛生玲，江 敏，常嘉琪，劉 洋，魏 淋，周建坤，張 芬，孫 勃，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，四川 成都 611130； 2.浙江大學(xué) 園藝系，浙江 杭州 310058)

芥藍(lán)(Brassicaalboglabra)屬十字花科蕓薹屬蔬菜，主要以花薹和嫩葉為食用器官，起源于我國(guó)南方，在廣東、福建等地區(qū)廣泛栽培[1]。芥藍(lán)具有悠久的栽培歷史和豐富的種質(zhì)資源，因其富含維生素C、芥子油苷、類胡蘿卜素及總酚等物質(zhì)，而具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健作用[2]，深受廣大人民群眾的喜愛。

類胡蘿卜素是萜類物質(zhì)[3]，在植物質(zhì)體中主要依靠2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸途徑(2-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway，MEP)合成[4]。1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase，DXS)是該途徑的首要限速酶，Lois等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在番茄的成熟過程中，DXS的表達(dá)量與類胡蘿卜素的積累成正比；Estévez等[6]通過在擬南芥中超量表達(dá)DXS基因，葉綠素、類胡蘿卜素、維生素E、赤霉素和脫落酸等萜類物質(zhì)的含量都提高了，而將DXS基因沉默后，這些物質(zhì)含量均降低了；潘夕春等[7]通過將番茄DXS基因轉(zhuǎn)入已重建了番茄紅素生物合成途徑的大腸埃希菌中，發(fā)現(xiàn)該菌能大量積累番茄紅素。這些研究結(jié)果顯示，DXS表達(dá)量的高低與上述萜類物質(zhì)的含量成正相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了DXS是萜類物質(zhì)生物合成途徑中的一個(gè)關(guān)鍵酶。目前，DXS基因已從番茄[7]、玉米[8]、魚腥草[9]、茉莉花[10]、思茅松[11]、土豆[12]等多種植物中成功分離，而芥藍(lán)中尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)該基因的報(bào)道。

本研究采用RT-PCR方法，以芥藍(lán)葉片為材料，首次分離出BaDXS1基因的CDS全長(zhǎng)，對(duì)該基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并構(gòu)建原核表達(dá)載體，將該基因轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌體內(nèi)，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究BaDXS1基因的生物學(xué)功能及芥藍(lán)中類胡蘿卜素的合成調(diào)控提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為白花芥藍(lán)品種明豐香菇，待幼苗長(zhǎng)出3～4片真葉，剪取其新鮮葉片進(jìn)行總RNA提取，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL2000 DNA Marker、EmeraldAmp Max PCR Master Mix(2×Premix)、Premixed Protein Marker(Broad)(6.5～200 ku)等購(gòu)于大連寶生物公司，SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、X-Gal、氨芐青霉素(Amp)等購(gòu)于上海生物工程有限公司，TransStartFastPfuFly DNA Polymerase聚合酶、pEASY-Blunt Cloning Kit、pEASY-Blunt E1 Expression Kit、BL21(DE3)表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞、Trans1-T1克隆感受態(tài)細(xì)胞等購(gòu)于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄cDNA合成

用改良的CTAB法[13]提取芥藍(lán)明豐香菇的總RNA，參照TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA模板的合成，所得產(chǎn)物于-20 ℃保存。

1.4 基因克隆

根據(jù)NCBI已公開的甘藍(lán)、白菜等同源物種的DXS基因序列設(shè)計(jì)芥藍(lán)特異性引物(表1)，引物送至上海生工生物工程公司合成。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(40 μL)：模板1.6 μL，引物(10 μmol·L-1)各1.6 μL，緩沖液8 μL，2.5 mmol·L-1dNTP 3.2 μL，Taq酶0.8 μL，ddH2O 23.2 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 20 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 33 s，共40個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min；12 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)合格后，用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒純化回收產(chǎn)物。將產(chǎn)物連接至平末端pEASY-Blunt克隆載體上，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌Trans1-T1克隆感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，經(jīng)菌液PCR篩選后，送至上海生工生物工程公司測(cè)序。

1.5 生物信息學(xué)分析

利用NCBI-ORF、ExPASy在線軟件計(jì)算其分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)等理化性質(zhì)；TMHMM軟件分析和推測(cè)蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)；WoLF PSORT軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)；ChloroP 1.1軟件預(yù)測(cè)是否存在轉(zhuǎn)運(yùn)肽；在NCBI網(wǎng)站上用BLAST程序及DNAMAN軟件進(jìn)行同源序列比對(duì)及保守結(jié)構(gòu)域分析； DNAMAN軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建[14-15]。

1.6 原核表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)

利用Rare Codon Calculator(RaCC)在線軟件對(duì)芥藍(lán)BaDXS1序列進(jìn)行稀有密碼子分析。將純化回收后的芥藍(lán)BaDXS1基因片段與原核表達(dá)載體pEASY-Blunt E1在25 ℃下連接30 min，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌Trans1-T1克隆感受態(tài)細(xì)胞，涂在LB(含Amp)固體培養(yǎng)基上，挑取白色單菌落，經(jīng)菌液PCR和測(cè)序等檢測(cè)，采用堿裂解法提取篩選出的重組質(zhì)粒pEASY-Blunt E1-BaDXS1。將提取的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸埃希菌表達(dá)感受態(tài)BL21(DE3)細(xì)胞，在D值為0.6～0.8、37 ℃條件下經(jīng)1 mmol·L-1的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)8 h后提取蛋白。最后，將處理的樣品取10 μL經(jīng)SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍(lán)染色，檢測(cè)目的蛋白在大腸埃希菌內(nèi)的表達(dá)情況和存在形式。

表1 芥藍(lán)BaDXS1基因克隆引物Table 1 The cloning primer of BaDXS1 in Brassica alboglabra

2 結(jié)果與分析

2.1 芥藍(lán)DXS1基因的克隆

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后(圖1)，得到一條約2 000 bp的條帶，與目的基因DXS的片段大小相符。測(cè)序后，確定該序列的CDS全長(zhǎng)為2 139 bp，并將其定名為芥藍(lán)BaDXS1。

2.2 生物信息學(xué)分析

利用NCBI-ORF和ExPASy軟件對(duì)芥藍(lán)BaDXS1基因所編碼的氨基酸進(jìn)行理化分析，結(jié)果表明，BaDXS1由712個(gè)氨基酸殘基組成，氨基酸種類和比例見圖2；分子式為C3417H5418N962O1019S29；理論分子量為77.21 ku，等電點(diǎn)(pI)為8.59，為堿性蛋白；不穩(wěn)定指數(shù)為36.69，屬穩(wěn)定蛋白；脂肪指數(shù)為85.07，平均親水系數(shù)為-0.160。利用TMHMM軟件預(yù)測(cè)BaDXS1蛋白無跨膜結(jié)構(gòu)。亞細(xì)胞定位軟件WoLF PSORT預(yù)測(cè)BaDXS1蛋白位于葉綠體。在線軟件ChloroP預(yù)測(cè)BaDXS1蛋白的N端具有41個(gè)氨基酸的質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列。

M，DL2000; 1，PCR產(chǎn)物。M，DL2000; 1，PCR products.圖1 BaDXS1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification products of BaDXS1

利用NCBI-CDD對(duì)BaDXS1氨基酸序列進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)分析(圖3)，發(fā)現(xiàn)該蛋白含TPP結(jié)合位點(diǎn)、轉(zhuǎn)酮醇結(jié)構(gòu)域、1-脫氧-木酮糖-5-磷酸合酶嘧啶結(jié)合功能域等多個(gè)結(jié)構(gòu)域。對(duì)BaDXS1氨基酸序列與6種不同植物的DXS氨基酸序列進(jìn)行NCBI-BLAST比對(duì)并結(jié)合DNAMAN軟件進(jìn)行分析，芥藍(lán)DXS1與甘藍(lán)(Brassicaoleracea，XP_013622774.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana，AAC49368.1)、番茄(Solanumlycopersicum，NP_001234672.1)、煙草(Nicotianatabacum，NP_001312959.1)、菠菜(Spinaciaoleracea，KNA08069.1)和橙子(Citrussinensis，KDO74968.1)的DXS氨基酸相似性分別為100%、84.56%、79.69%、79.78%、77.27%和78.84%。序列比對(duì)結(jié)果表明，DXS氨基酸序列的相似性較高，說明該蛋白在進(jìn)化過程中高度保守，且C端序列相較于N端序列保守(圖4)，ChloroP 1.1預(yù)測(cè)顯示BaDXS1的N端含一段41個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列。

圖2 芥藍(lán)BaDXS1蛋白的氨基酸組成Fig.2 Amino acid composition of BaDXS1

圖3 BaDXS1蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.3 Conserved domains analysis of BaDXS1

Ba，芥藍(lán); Bo，甘藍(lán); At，擬南芥; Sl，番茄; Nt，煙草; So，菠菜; Cs，橙子。Ba，Brassica alboglabra; Bo，Brassica oleracea (XP_013622774.1); At，Arabidopsis thaliana (AAC49368.1); Sl，Solanum lycopersicum (NP_001234672.1); Nt，Nicotiana tabacum (NP_001312959.1); So，Spinacia oleracea (KNA08069.1); Cs，Citrus sinensis (KDO74968.1).圖4 DXS蛋白的氨基酸序列比對(duì)Fig.4 Alignment of deduced amino acid sequences of DXS

根據(jù)NCBI已公布的不同物種的DXS氨基酸序列，選取16種與芥藍(lán)BaDXS1蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，采用鄰近法(neighbor-joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)。該進(jìn)化樹分為3個(gè)大的分支，第一大分支包括十字花科的芥藍(lán)、甘藍(lán)、歐洲油菜、白菜、蘿卜、薺菜及擬南芥和茄科的煙草、番茄、土豆及南非醉茄2個(gè)小支；第二大分支包括蕓香科的克萊門柚及橙子和大戟科的橡膠樹、麻瘋樹及蓖麻2個(gè)小支；楊柳科的毛果楊單獨(dú)形成1支。結(jié)果表明，同科物種間的DXS在進(jìn)化過程中親緣關(guān)系較近，其中十字花科芥藍(lán)BaDXS1與其同屬的甘藍(lán)BoDXS親緣關(guān)系最近。

2.3 原核表達(dá)

將重組質(zhì)粒pEASY-Blunt E1-BaDXS1轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，提取總蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)(圖6)，在66.4～97.2 ku間出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)測(cè)蛋白的相對(duì)分子量77.21 ku基本一致，表明芥藍(lán)BaDXS1蛋白在大腸埃希菌體內(nèi)成功表達(dá)。進(jìn)一步分離上清和沉淀中的蛋白，檢測(cè)結(jié)果顯示，大部分目的蛋白存在于沉淀中，表明該蛋白在大腸埃希菌體內(nèi)主要以包涵體的形式存在。

3 討論

在植物中，DXS作為MEP途徑的首要限速酶，最早是在胡椒薄荷[16]和擬南芥[17]中分離獲得的。本研究首次分離了芥藍(lán)DXS1基因，該基因CDS區(qū)全長(zhǎng)為2 139 bp，可編碼712個(gè)氨基酸。對(duì)BaDXS1蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)和分析，顯示該蛋白很可能位于葉綠體。根據(jù)BaDXS1蛋白氨基酸序列與其他6個(gè)不同物種的DXS氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該序列N端相較于C端的保守性較差。BaDXS1蛋白的N端序列中富含絲氨酸和蘇氨酸，而含少量的酸性氨基酸，這與葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的性質(zhì)相符，該結(jié)果與BaDXS1蛋白的亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。推測(cè)該蛋白是在葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的引導(dǎo)下，定位于葉綠體，而該蛋白的C端序列因含多種結(jié)構(gòu)域而高度保守，其可能在葉綠體內(nèi)催化丙酮酸和3-磷酸甘油醛合成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸這個(gè)過程中起作用[11]。

圖5 17種不同物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of 17 different species

M，Protein marker(6.5～200 ku); 1～4，總蛋白檢測(cè); 5～6，上清中蛋白檢測(cè); 7～8，沉淀中蛋白檢測(cè)。1，未誘導(dǎo)空載; 2，誘導(dǎo)空載; 3，未誘導(dǎo)BL21(DE3)(pEASY-Blunt E1-BaDXS1); 4，誘導(dǎo)8 h的BL21(DE3)(pEASY-Blunt E1-BaDXS1); 5、7，未誘導(dǎo)BL21(DE3)(pEASY-Blunt E1-BaDXS1); 6、8，誘導(dǎo)8 h的BL21(DE3)(pEASY-Blunt E1-BaDXS1)。M，Protein marker(6.5～200 ku); 1-4，Detection of total protein; 5-6，Detection of protein in the supernatant; 7-8，detection of protein precipitation; 1，non-induced control; 2，Induced control; 3，Non-induced expression products of pEASY-Blunt E1-BaDXS1 in BL21(DE3); 4，pEASY-Blunt E1-BaDXS1 transformed bacterial cells induced respectively for 8 h in BL21(DE3); 5，7，non-induced expression products of pEASY-Blunt E1-BaDXS1 in BL21(DE3); 6，8，pEASY-Blunt E1-BaDXS1 transformed bacterial cells induced respectively for 8 h in BL21(DE3).圖6 重組質(zhì)粒pEASY-Blunt E1-BaDXS1在大腸埃希菌中的表達(dá)檢測(cè)Fig.6 Expression of pEASY-Blunt E1-BaDXS1 in Escherichia coli

本研究中，BaDXS1蛋白在大腸埃希菌中成功表達(dá)，但其表達(dá)量較低。外源基因結(jié)構(gòu)(如密碼子偏好性)和表達(dá)條件均會(huì)影響外源基因在大腸埃希菌體內(nèi)的表達(dá)[18]。本實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)BaDXS1基因進(jìn)行稀有密碼子分析，發(fā)現(xiàn)該基因具有多個(gè)稀有密碼子，其中含1個(gè)六聯(lián)體和多個(gè)二聯(lián)體，當(dāng)外源基因中含有成串或多個(gè)大腸埃希菌稀有密碼子時(shí)，則會(huì)導(dǎo)致翻譯很難進(jìn)行，目的蛋白表達(dá)量過低[19]。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)過程中采用的是不含稀有密碼子的大腸埃希菌表達(dá)感受態(tài)BL21(DE3)，這可能是導(dǎo)致該蛋白表達(dá)量較低的原因之一；另一方面，依據(jù)劉永強(qiáng)等[20]研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白在大腸埃希菌中的表達(dá)量產(chǎn)生顯著影響，而誘導(dǎo)前菌液濃度和IPTG濃度對(duì)蛋白的表達(dá)量影響不顯著。本實(shí)驗(yàn)中采用的誘導(dǎo)溫度為37 ℃、誘導(dǎo)時(shí)間為8 h，可能是由于誘導(dǎo)溫度較高、誘導(dǎo)時(shí)間較短，進(jìn)而影響重組蛋白在菌體內(nèi)的表達(dá)量較低。我們將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用含有稀有密碼子的大腸埃希菌表達(dá)感受態(tài)細(xì)胞、降低誘導(dǎo)溫度及延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間等手段，進(jìn)一步優(yōu)化原核表達(dá)體系，使BaDXS1蛋白獲得高效表達(dá)。

不同植物中，DXS基因家族成員的數(shù)目及功能也各自不同，如番茄只有1個(gè)DXS基因[5]，擬南芥中有3個(gè)DXS基因，但只有1個(gè)DXS蛋白具有催化功能[21]，柑橘中有3個(gè)DXS基因，其中CitDXS1起主要作用[22]。目前，芥藍(lán)中還未發(fā)現(xiàn)有關(guān)BaDXS基因家族成員的數(shù)目及相應(yīng)功能的報(bào)道。本研究為進(jìn)一步研究BaDXS1基因功能奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)也有助于芥藍(lán)DXS基因家族其他成員的分離及功能研究。

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