水稻“抗癌”新因子bsr-d1

2018-05-22 03:22李偉滔朱紫薇尹俊杰賀閩王靜朱孝波陳學(xué)偉

自然雜志 2018年2期

李偉滔，朱紫薇，尹俊杰，賀閩，王靜，朱孝波，陳學(xué)偉

四川農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所，成都 611130

水稻是重要的糧食作物，世界約一半的人口以它為主食。然而，水稻第一大真菌病害——稻瘟病，被稱為水稻“癌癥”，嚴(yán)重危害水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。自20世紀(jì)60年代中期起，科學(xué)家便開始了鑒定和克隆水稻稻瘟病抗性相關(guān)基因的工作。目前鑒定到的稻瘟病抗性(resistance，R)基因中，已有28個被成功克隆。這些基因中，僅Pid2和Pi21屬于非經(jīng)典R基因[2-3]。R基因聚合是當(dāng)前水稻抗病育種的主要技術(shù)手段，但費(fèi)時費(fèi)力，而在水稻抗病育種中能夠直接被應(yīng)用的廣譜抗病基因資源匱乏，嚴(yán)重限制了抗病育種技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用。本文介紹了如何挖掘水稻廣譜抗稻瘟病遺傳位點(diǎn)bsr-d1并解析其抗病機(jī)理，同時闡述了其潛在的育種應(yīng)用價值。

1 挖掘廣譜抗稻瘟病遺傳位點(diǎn)bsr-d1

水稻“地谷”是福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院在20世紀(jì)90年代初育成的水稻保持系，具有對稻瘟病的廣譜持久高抗性[4]。盡管已從“地谷”中鑒定并克隆出兩個抗病基因——Pid2和Pid3，但這兩個基因均具有小種特異性抗性[2,5]。近期研究表明“地谷”的廣譜持久抗性既不同于LysM結(jié)構(gòu)域蛋白，如幾丁質(zhì)誘導(dǎo)物結(jié)合蛋白(CEBiP)等所介導(dǎo)的抗性，也不同于含有核苷酸結(jié)合位點(diǎn)和富含亮氨酸重復(fù)序列(NBS-LRR)的蛋白介導(dǎo)的抗性[4]。因此，“地谷”中可能存在其他新型因子來介導(dǎo)對稻瘟病的廣譜持久抗性。

農(nóng)作物如果攜帶了廣譜抗病基因，則不會因?yàn)椴≡淖儺惗タ剐?，因此在田間表現(xiàn)出持久抗病性。然而，抗病基因常伴隨著品質(zhì)差或產(chǎn)量低的副作用，因此在育種中難以利用。采用常規(guī)的遺傳定位的方法，獲得的抗病相關(guān)基因通常具有小種特異性。如：前期從“地谷”中鑒定并克隆的Pid2和Pid3，均具有小種特異性抗性[2,5]。因此，很難用這種方法尋找到廣譜抗病位點(diǎn)。我們研究團(tuán)隊針對水稻“地谷”的重測序數(shù)據(jù)，以及從國家作物基因資源庫中隨機(jī)篩選得到的66份非廣譜抗病水稻材料的重測序數(shù)據(jù)，通過全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)獲得“地谷”的特異的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(singlenucleotide polymorphism，SNP)。然后，利用稻瘟病抗病材料“地谷”和易感稻瘟病材料“麗江新團(tuán)黑谷”構(gòu)建重組自交系群體(recombinant inbred line，RIL)。首先篩選“地谷”特異的SNP，并將分布在外顯子內(nèi)改變氨基酸變化或?qū)е路g提前終止的SNP，以及位于啟動子1.5 kb內(nèi)且位于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的順式作用元件的核心序列內(nèi)的SNP作為候選分析有效的SNP。然后，利用構(gòu)建的RIL群體，從中篩選到不含Pid2和Pid3，且表型與麗江新團(tuán)黑谷相似的株系作為候選基因的篩選材料。將稻瘟病病區(qū)種植所選的RIL株系種植于大田自然發(fā)病區(qū)，進(jìn)行抗性鑒定。然后，利用篩選到的SNP，開發(fā)衍生的酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(dCAPS)標(biāo)記。利用分子標(biāo)記與RIL株系抗性結(jié)果的關(guān)聯(lián)分析，明確了與稻瘟病廣譜抗性相關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵位點(diǎn)SNP33，它位于MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的順式作用元件的核心序列內(nèi)。我們將這個SNP33所在的基因命名為Bsr-d1，而“地谷”中對應(yīng)的基因即為bsr-d1[6]。

2 Bsr-d1編碼一個新的稻瘟病抗病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子

為分析Bsr-d1的分子功能，我們分別構(gòu)建了Bsr-d1的RNA干涉、CRISPR/Cas9基因敲除和過量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因水稻株系。通過稻瘟病接菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Bsr-d1的RNA干涉和CRISPR/Cas9敲除株系均表現(xiàn)出稻瘟病抗性增強(qiáng)，并且這種抗性具有廣譜性，而過量表達(dá)株系表現(xiàn)為抗性減弱[6]。因此，bsr-d1是調(diào)控稻瘟病廣譜抗性的新的遺傳位點(diǎn)。

Bsr-d1編碼一個C2H2家族的轉(zhuǎn)錄因子，它對稻瘟病抗性起著負(fù)調(diào)控作用。在植物免疫信號傳導(dǎo)中，轉(zhuǎn)錄因子精細(xì)調(diào)控下游靶基因是調(diào)控防御機(jī)制所必須的[7]。利用基因芯片(microarray)和轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)技術(shù)，已鑒定出大量受病原菌影響的轉(zhuǎn)錄因子[4,8]，這些參與植物抗病的轉(zhuǎn)錄因子主要分布在5個轉(zhuǎn)錄因子家族中——WRKY、APETALA2/乙烯應(yīng)答因子(AP2/ERF)、堿性亮氨酸拉鏈(bZIP)、堿性螺旋-環(huán)-螺旋類轉(zhuǎn)錄因子(bHLH)和NAM/ATAF/CUC(NAC)[7]。此前，尚未報道C2H2類型轉(zhuǎn)錄因子對植物抗病的調(diào)控作用。

Bsr-d1屬于調(diào)控稻瘟病抗性的一類新的非WRKY家族轉(zhuǎn)錄因子。目前，水稻中參與稻瘟病抗性的轉(zhuǎn)錄因子多屬于WRKY家族[9]，而調(diào)控稻瘟病抗性的非WRKY轉(zhuǎn)錄因子還十分少見，僅有OsERF922和OsNAC111。OsERF922負(fù)調(diào)控水稻稻瘟病的抗性，其主要影響苯丙氨酸氨裂解酶基因和雙萜類植物抗毒素合成相關(guān)基因的表達(dá)[10]；OsNAC111正調(diào)控水稻的稻瘟病抗性，這依賴于它對幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶基因表達(dá)的激活作用[11]。Bsr-d1對稻瘟病抗性并不依賴于OsERF922和OsNAC111[6]。

與大多數(shù)水稻抗病基因編碼受體蛋白不同，bsr-d1基因編碼的是控制免疫反應(yīng)強(qiáng)弱的調(diào)節(jié)蛋白。這可能是稻瘟病菌不能在攜帶該位點(diǎn)的“地谷”上產(chǎn)生強(qiáng)致病性的原因。

3 bsr-d1介導(dǎo)一種新型抗稻瘟病分子機(jī)制

活性氧(reactive oxygen species，ROS)爆發(fā)是植物細(xì)胞應(yīng)對病原菌侵害的早期反應(yīng)，它也是病原分子模式激發(fā)的免疫反應(yīng)(PAMPs triggered immunity，PTI)中的一個重要現(xiàn)象[12]。植物細(xì)胞中，過氧化氫(H2O2)作為ROS的主要成分之一，它可通過增強(qiáng)植物細(xì)胞壁來阻擋病原菌的入侵[13]。H2O2還可介導(dǎo)植物防御反應(yīng)的信號級聯(lián)放大，從而產(chǎn)生抗病反應(yīng)[14]。例如：H2O2能夠激活抗病相關(guān)的MPK3/MPK6級聯(lián)反應(yīng)[15]，其中MPK3/MPK6能夠磷酸化WRKY33和ERF6，從而調(diào)控抗病相關(guān)的乙烯、抗毒素和吲哚基硫苷的合成，進(jìn)而影響植物抗病性[15]。

ROS的爆發(fā)是抗病反應(yīng)的起始，增強(qiáng)ROS合成[13-14]或削弱ROS降解[16]，均可顯著增強(qiáng)植物抗病性。當(dāng)前研究多數(shù)集中于ROS的合成途徑，而有關(guān)ROS降解途徑的研究較少。番茄基因Cat1和Cat2參與降解H2O2，它們的表達(dá)受抑制后，番茄中H2O2積累量增加，PR1蛋白和水楊酸(salicylic acid，SA)含量升高，從而促進(jìn)細(xì)胞壞死，增強(qiáng)對煙草花葉病毒的抗性[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，bsrd1主要調(diào)控過氧化氫酶基因的表達(dá)，以此實(shí)現(xiàn)對ROS的調(diào)控(圖1)：在bsr-d1或Bsr-d1敲除水稻中，過氧化氫降解酶基因表達(dá)降低，水稻中過氧化氫降解減弱，導(dǎo)致H2O2富集，使水稻抗病性明顯提高[6]。bsr-d1的這種抗病調(diào)控機(jī)制，不同于以往報道的由H2O2合成相關(guān)基因OsRbohA、OsRbohB和OsRbohE介導(dǎo)的抗病機(jī)制[17]。

圖1 bsr-d1介導(dǎo)水稻稻瘟病抗性的分子模型。稻瘟病菌侵染水稻后，能夠誘導(dǎo)bsr-d1的上調(diào)表達(dá)，進(jìn)而使過氧化氫酶上調(diào)表達(dá)，加速了H2O2的降解，從而減少了H2O2的積累，使水稻感??；而“地谷”中，等位基因bsr-d1由于其啟動子位點(diǎn)由原來的A變成G，導(dǎo)致MYBS1強(qiáng)烈地結(jié)合bsr-d1啟動子，抑制bsr-d1的上調(diào)表達(dá)，因此，過氧化氫酶并沒有被誘導(dǎo)表達(dá)，使H2O2保持一定的積累量，以此增強(qiáng)了水稻的稻瘟病抗性

4 bsr-d1的育種應(yīng)用潛力

堊白是衡量稻米品質(zhì)的重要性狀之一，直接影響稻米的外觀品質(zhì)、加工品質(zhì)和商品流通[18]。非R基因中，pi21具有稻瘟病廣譜抗性，但是它與控制堊白的基因LOC_Os04g32890緊密連鎖[3]。水稻育種中，需打破pi21與LOC_Os04g32890的連鎖，才能保證提高抗病性的同時不破壞水稻品質(zhì)，這大大增加了育種難度，因此極大限制了pi21在生產(chǎn)上的實(shí)際應(yīng)用。

水稻籽粒堊白相關(guān)的QTL主要位于水稻染色體1、2、4～12[19-20]，而3號染色體上未發(fā)現(xiàn)有控制堊白的QTL。Bsr-d1位于3號染色體前臂靠近著絲粒的位置(Chr3:18 436～18 437 kb)，該位點(diǎn)附近沒有發(fā)現(xiàn)控制堊白及其相關(guān)的基因，故bsr-d1不同于pi21，無需分離與其緊密連鎖的控制堊白的基因即可用于水稻抗性育種。敲除Bsr-d1后，水稻的稻瘟病抗性提高，而與水稻產(chǎn)量相關(guān)的農(nóng)藝性狀以及主要的品質(zhì)性狀——堊白率和堊白度，卻未受到顯著影響。這進(jìn)一步表明含有與“地谷”位點(diǎn)一致的bsr-d1在育種中具有很大的應(yīng)用潛力。

此外，生物信息學(xué)分析表明，目前已經(jīng)測序的全球3 000份水稻資源中，僅約10%的水稻材料含有與“地谷”bsr-d1相同的等位位點(diǎn)(圖1)[6]，表明bsr-d1具有廣闊的育種應(yīng)用前景。

5 總結(jié)與展望

控制植物病害的主要手段包括施用化學(xué)農(nóng)藥和種植抗病品種。大量施用化學(xué)農(nóng)藥雖能控制病害發(fā)生，但農(nóng)藥的使用不僅增加農(nóng)民種植成本，還不可避免地會導(dǎo)致農(nóng)藥殘留及破壞生態(tài)環(huán)境。作為防控植物病害最經(jīng)濟(jì)有效的手段，種植抗病品種可有效保證農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中的資源節(jié)約和環(huán)境保護(hù)，這對于生態(tài)文明建設(shè)具有十分重要的意義[21]?？共』?，特別是廣譜抗病基因的挖掘是培育抗病品種的重要基礎(chǔ)。但目前對植物的廣譜抗病基因還知之甚少，已報道的廣譜抗病基因主要包括小麥的Yr36[22]和Lr34[23]，大麥的mlo[24]，擬南芥的RPW8[25]，水稻的STV11[26]、pi21[3]、Xa21[27]、Xa23[28]、Pi9[29]和Pigm[30]。

本文通過全基因組關(guān)聯(lián)分析和遺傳群體的結(jié)合利用，篩選和鑒定出“地谷”中的廣譜抗病位點(diǎn)bsr-d1，為克隆控制目標(biāo)性狀的基因提供了新策略。Bsr-d1編碼的蛋白能調(diào)節(jié)水稻對稻瘟病的免疫反應(yīng)程度，以防止水稻因過度免疫造成自身傷害。稻瘟病菌中可能存在一個或一些未知的因子，通過誘導(dǎo)Bsr-d1高量表達(dá)，使過氧化氫酶過量表達(dá)，加速H2O2的降解，從而減少H2O2的積累，降低水稻對稻瘟病菌的抵抗能力。“地谷”中的bsr-d1基因通過自然變異，不再“聽令”于稻瘟病菌，在受到稻瘟菌侵染時不會增加表達(dá)，使得稻瘟病菌的這一個秘密武器失去作用，從而擺脫稻瘟病菌的“控制”[31]。同時，“地谷”的bsr-d1具有對稻瘟病的廣譜抗性，且對水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)性狀無顯著影響，為水稻的抗病育種工作提供了更有效的目標(biāo)基因，在水稻抗病育種中具有很大的應(yīng)用潛力。

(2017年9月6日收稿)■

參考文獻(xiàn)

[1] DEAN R, VAN KAN J A L, PRETORIUS Z A, et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology [J]. Mol Plant Pathol,2012, 13(7): 414-430.

[2] CHEN X, SHANG J, CHEN D, et al. A B-lectin receptor kinase gene conferring rice blast resistance [J]. Plant J, 2006, 46(5): 794-804.

[3] FUKUOKA S, SAKA N, KOGA H, et al. Loss of function of a prolinecontaining protein confers durable disease resistance in rice [J].Science, 2009, 325(5943): 998-1001.

[4] LI W, LIU Y, WANG J, et al. The durably resistant rice cultivar Digu activates defence gene expression before the full maturation ofMagnaporthe oryzaeappressorium [J]. Mol Plant Pathol, 2016, 17(3):354-368.

[5] SHANG J, TAO Y, CHEN X, et al. Identification of a new rice blast resistance gene,Pid3, by genomewide comparison of paired nucleotide-binding site-leucine-rich repeat genes and their pseudogene alleles between the two sequenced rice genomes [J]. Genetics, 2009,182(4): 1303-1311.

[6] LI W, ZHU Z, CHERN M, et al. A natural allele of a transcription factor in rice confers broad-spectrum blast resistance [J]. Cell, 2017,170: 114-126.

[7] SEO E, CHOI D. Functional studies of transcription factors involved in plant defenses in the genomics era [J]. Briefings in Functional Genomics, 2015, 14(4): 260-267.

[8] WEI T, OU B, LI J, et al. Transcriptional profiling of rice early response toMagnaporthe oryzaeidentified OsWRKYs as important regulators in rice blast resistance [J]. Plos One, 2013, 8(3): e59720.

[9] LIU J, CHEN X, LIANG X, et al. Alternative splicing of rice WRKY62 and WRKY76 transcription factor genes in pathogen defense [J]. Plant Physiol, 2016, 171(2): 1427-1442.

[10] LIU D, CHEN X, LIU J, et al. The rice ERF transcription factor OsERF922 negatively regulates resistance toMagnaporthe oryzaeand salt tolerance [J]. J Exp Bot, 2012, 63(10): 3899-3911.

[11] YOKOTANI N, TSUCHIDA-MAYAMA T, ICHIKAWA H, et al.OsNAC111, a blast disease-responsive transcription factor in rice,positively regulates the expression of defense-related genes [J]. Mol Plant Microbe Interact, 2014, 27(10): 1027-1034.

[12] NURNBERGER T, BRUNNER F, KEMMERLING B, et al. Innate immunity in plants and animals: striking similarities and obvious differences [J]. Immunol Rev, 2004, 198: 249-266.

[13] TORRES M A, JONES J D G, DANGL J L. Reactive oxygen species signaling in response to pathogens [J]. Plant Physiol, 2006, 141(2):373-378.

[14] BINDSCHEDLER L V, DEWDNEY J, BLEE K A, et al. Peroxidasedependent apoplastic oxidative burst in Arabidopsis required for pathogen resistance [J]. Plant J, 2006, 47(6): 851-863.

[15] SIDDHI K J, ALOK K S. ROS mediated MAPK signaling in abiotic and biotic stress-striking similarities and differences [J]. Front Plant Sci, 2015, 6: 769.

[16] TAKAHASHI H, CHEN Z, DU H, et al. Development of necrosis and activation of disease resistance in transgenic tobacco plants with severely reduced catalase levels [J]. Plant J, 1997, 11(5): 993-1005.

[17] WONG H L, PINONTOAN R, HAYASHI K, et al. Regulation of rice NADPH oxidase by binding of Rac GTPase to its N-terminal extension[J]. Plant Cell, 2007, 19: 4022-4034.

[18] FITZGERALD M A, MCCOUCH S R, HALL R D. Not just a grain of rice: the quest for quality [J]. Trends Plant Sci, 2009, 14(3): 133-139.

[19] BIAN J M, SHI H, LI C J, et al. QTL mapping and correlation analysis for 1000-grain weight and percentage of grains with chalkiness in rice[J]. Journal of Genetics, 2013, 92(2): 281-287.

[20] CHEN L K, GAO W W, CHEN S P, et al. High-resolution QTL mapping for grain appearance traits and co-localization of chalkiness-associated differentially expressed candidate genes in rice [J]. Rice,2016, 9: 1-17.

[21] 肖亮, 蔣建雄, 易自力, 等. 水稻抗稻瘟病分子育種的現(xiàn)狀及展望[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2006, 15(1): 79-84.

[22] FU D L, UAUY C, DISTELFELD A, et al. A kinase-START gene confers temperature-dependent resistance to wheat stripe rust [J].Science, 2009, 323(5919): 1357-1360.

[23] CHEN H, IQBAL M, YANG R C, et al. Effect of Lr34/Yr18 on agronomic and quality traits in a spring wheat mapping population and implications for breeding [J]. Mol Breeding, 2016, 36: 53.

[24] MIKLIS M, CONSONNI C, BHAT R A, et al. Barley MLO modulates actin-dependent and actin-independent antifungal defense pathways at the cell periphery [J]. Plant Physiol, 2007, 144(2): 1132-1143.

[25] XIAO S, ELLWOOD S, CALIS O, et al. Broad-spectrum mildew resistance inArabidopsis thalianamediated by RPW8 [J]. Science,2001, 291(5501): 118-120.

[26] WANG Q, LIU YQ, HE J, et al. STV11 encodes a sulphotransferase and confers durable resistance to rice stripe virus [J]. Nat Commun,2014, 5: 4768.

[27] LEE S W, HAN S W, SRIRIYANUM M, et al. A type I-secreted,sulfated peptide triggers XA21-mediated innate immunity [J].(Retracted article. See vol. 342, pg. 191, 2013). Science, 2009,326(5954): 850-853.

[28] WANG C L, ZHANG X P, FAN Y L, et al. XA23 is an executor R protein and confers broad-spectrum disease resistance in rice [J]. Mol Plant, 2015, 8(2): 290-302.

[29] QU S, LIU G, ZHOU B, et al. The broad-spectrum blast resistance gene Pi9 encodes a nucleotide-binding site-Leucine-rich repeat protein and is a member of a multigene family in rice [J]. Genetics, 2006,172(3): 1901-1914.

[30] DENG Y, ZHAI K, XIE Z, et al. Epigenetic regulation of antagonistic receptors confers rice blast resistance with yield balance [J]. Science,2017, 355: 962-965.