郭鵬輝，韋 體，劉慧霞，高丹丹，臧榮鑫，盧建雄，蔡 勇，楊具田

(西北民族大學生命科學與工程學院,甘肅 蘭州 730030)

隨著天然草地退化、土地資源緊缺以及人畜爭糧等問題的日益突出，加之傳統(tǒng)畜牧業(yè)生產對糧食的過度依賴，使得大力發(fā)展節(jié)糧型、經濟型的現(xiàn)代畜牧業(yè)成為我國畜牧業(yè)發(fā)展的趨勢之一。秸稈作為農業(yè)生產系統(tǒng)中一項重要的再生性生物資源，是世界上最豐富的動物飼料來源之一[1]。據估計，全世界每年可產生近29億 t的秸稈，其中66%直接還田或作為生活能源而被焚燒掉，僅有12%作為草食家畜的飼料[2]。而作為一個秸稈資源極其豐富的農業(yè)大國，中國每年由各類農作物產生的秸稈總量超過8億t，并且具有逐年遞增的趨勢[3]。同時在傳統(tǒng)的秸稈資源利用方式過程中，一方面，大約有1/3的秸稈資源被就地焚燒掉，這種利用方式不僅嚴重污染了當地的生態(tài)環(huán)境，更是造成了農業(yè)資源的極大浪費[4]；另一方面，作物秸稈中粗纖維含量高(30%～45%)，粗蛋白含量低(2%～5%)，導致秸稈的消化率都很低，一般只有35%～50%[5]，這限制了反芻家畜對秸稈的利用，致使采食量下降，無法滿足其需求。所以，目前僅有不到10%的秸稈被用作飼料，如果用2億 t秸稈通過微生物進行加工處理并用作飼料，每年可節(jié)約飼料糧0.8億t左右，相當于飼料用糧的50%左右[6]。因此，如何合理利用產量如此巨大的農作物秸稈，不僅對于保護種植地的農業(yè)生態(tài)環(huán)境，促進當地農民增收有重要的現(xiàn)實意義，而且對于解決我國畜牧業(yè)現(xiàn)代化發(fā)展過程中飼草的短缺問題具有重要的戰(zhàn)略意義[7]。

紫蘇(Perillafrutescens)，俗稱荏，又名紅蘇、赤蘇、紅紫蘇或香蘇，是唇形科紫蘇屬的一年生草本植物，在我國已有2 000多年的栽培種植歷史，主要用于醫(yī)療、食品和保健等領域，目前在我國西北、東北地區(qū)基本形成了兩個傳統(tǒng)的油用紫蘇主產區(qū)。紫蘇全株都具有很高的開發(fā)利用價值，是國家衛(wèi)生部首批頒布既是藥品又是食品的60種植物之一[8]。研究發(fā)現(xiàn)，紫蘇根、莖、葉及籽實中富含各種氨基酸、維生素及微量元素等營養(yǎng)成分，其秸稈中纖維素和半纖維素的含量可達62.7%，另外還含有少量的有機溶劑抽提物(包括樹脂、脂肪、蠟等)、色素及灰分等[9]。在雞、豬、牛、羊等不同動物日糧中添加紫蘇提取物后，肉雞的生產性能提高，免疫力增強[10]，蛋種雞的生產和繁殖性明顯改善[11]，生長育肥豬的生長發(fā)育、肉品質及免疫性得到改善[12]，育肥牛的免疫球蛋白A含量、牛肉嫩度、胴體品質等得到提高[13]，湖羊瘤胃發(fā)酵功能增強，且日糧中粗蛋白和粗脂肪的表觀消化率顯著增加[14]。因此，紫蘇可以作為動物日糧中一種很好的飼料來源加以開發(fā)利用[15]。

然而，目前人們對紫蘇這一植物的研究主要聚焦在其活性成分、遺傳特性、資源分布、栽培種植等方面[16-17]，而對其副產品秸稈資源的研究利用缺乏關注。因此，本研究通過微生物發(fā)酵法獲得發(fā)酵后的紫蘇秸稈飼料，并進行其發(fā)酵飼料的品質評價和營養(yǎng)成分分析，旨在為紫蘇秸稈資源的飼料化利用研究提供理論依據和技術參考。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料紫蘇秸稈，是將種植在甘肅省慶陽市寧縣大田中的紫蘇刈割、去掉籽實并經自然風干后的剩余物。強微99生酵劑及粗纖維降解劑均由強微(宜春)生物科技有限公司提供，里氏木霉RUT C-30(CICC13052)購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 試驗方法

1.2.1發(fā)酵菌種的制備

里氏木霉PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、瓊脂15 g、葡萄糖20 g，pH 4.8，蒸餾水1 000 mL。

里氏木霉液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、蛋白1 g、(NH4)2SO43.0 g、CaCl2·2H2O 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.03 g，1 mL·L-1微量元素濃縮液，1 mol·L-1檸檬酸緩沖液，pH 4.8，蒸餾水1 000 mL。

強微99生酵劑及粗纖維降解劑的配置按照公司給定的使用說明進行。

1.2.2發(fā)酵試驗設計 將采集的紫蘇秸稈通過粉碎機粉碎成粉末狀，過0.425 mm篩，然后分別稱取1 kg粉碎后的紫蘇秸稈樣品，按照以下5個處理方法進行處理，分別為對照組、試驗組Ⅰ(添加20%玉米粉+1 g·kg-1強微99生酵劑+1 g·kg-1粗纖維降解劑+50 mL·kg-1里氏木霉發(fā)酵液)、試驗組Ⅱ(添加20%玉米粉+1 g·kg-1強微99生酵劑)、試驗組Ⅲ(添加20%玉米粉+1 g·kg-1粗纖維降解劑)、試驗Ⅳ(添加20%玉米粉+50 mL·kg-1里氏木霉發(fā)酵液)，每個處理設3個重復，各個處理混合均勻后裝入錫箔袋中(每袋1 kg)用封口機真空密封，然后放置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行固體厭氧發(fā)酵，發(fā)酵時間為7 d，發(fā)酵結束后，將發(fā)酵好的秸稈飼料置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品測定

1.3.1營養(yǎng)成分的測定 發(fā)酵結束后，通過四分法從每個發(fā)酵袋中取出25 g發(fā)酵飼料樣品，置于65 ℃烘箱中烘干(48 h)后進行干物質(dry matter，DM)含量測定。根據《飼料分析及飼料質量檢測技術》[18]的方法測定發(fā)酵飼料中的營養(yǎng)成分，采用高溫灼燒法測定粗灰分(Ash)的含量，采用凱氏定氮儀(K9840,山東海能)測定粗蛋白質(crude protein,CP)含量，采用脂肪測定儀(SOX406,山東海能)測定粗脂肪(ether extract,EE)含量，采用粗纖維測定儀(F800,山東海能)測定粗纖維(crude fiber,CF)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber,NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber,ADF)以及酸性木質素(acid detergent lignin，ADL)的含量。

1.3.2pH與揮發(fā)性脂肪酸含量測定 稱取發(fā)酵后的紫蘇秸稈飼料20 g放入三角瓶中，并加入180 mL蒸餾水攪拌均勻，然后靜置浸泡24 h后，先將浸泡液用兩層紗布過濾，再將過濾后的濾液用定量濾紙過濾2次，即可得到浸提液并用pH計測定其pH。揮發(fā)性脂肪酸的測定參考文獻[19]的方法進行，采用日本島津(GC-14B)高效液相色譜儀分析檢測浸上述所獲提液中的乙酸(acetic acid，AA)、丙酸(propionic acid，PA)及丁酸(botanic acid，BA)含量。檢測柱：毛細管柱(長30 m，內徑0.53 mm)；檢測器：FID(溫度200 ℃)；載氣：高純氮氣(壓力0.7 MPa，流速30 NL·min-1)；燃氣：氫氣(流量30 mL·min-1)；氣化室溫度：250 ℃；分析靈敏度：101，衰減度25。

1.3.3紫蘇秸稈發(fā)酵飼料的感官評定 根據《農業(yè)部青貯飼料質量評定標準》[20]，對發(fā)酵后的紫蘇秸稈飼料情況進行現(xiàn)場感官評定，分別為色澤15分，氣味15分，質地10分。最終總評分(Score,S)結果分為優(yōu)等(30分

1.3.4紫蘇秸稈飼料發(fā)酵品質評定 發(fā)酵品質的評定根據V-Score評價體系[21]的方法進行評定，具體評分標準如表1所列。

表1 V-Score評分標準Table 1 Calculation method for the V-Score

1.4 數據處理與統(tǒng)計分析

數據處理結果以平均值±標準誤的方式表示，具體分析采用Excel與SPSS 20.0軟件中的One-way ANOVA對不同處理進行單因素方差分析(P<0.05)和LSD法多重比較。

2 結果與分析

2.1 紫蘇秸稈發(fā)酵飼料的營養(yǎng)成分

經不同發(fā)酵方法處理后的紫蘇秸稈飼料干物質含量顯著低于對照(P<0.05)，但不同處理之間差異不顯著(P>0.05)(表2)。經不同方法處理后的紫蘇秸稈粗蛋白(CP)和粗脂肪(EE)含量明顯升高(P<0.05)，粗脂肪含量尤以混合處理(試驗組Ⅰ)后的效果最為顯著；而粗纖維含量(CF)相對于對照組而言顯著降低(P<0.05)，但混合處理(試驗組Ⅰ)和里氏木霉發(fā)酵液處理(試驗組Ⅳ)的效果較為明顯，且與對照(62.94%)相比，試驗組Ⅰ和Ⅳ的CF含量均降為46%左右。粗灰分(Ash)各處理組之間的變化不大(P>0.05)?；旌咸幚?試驗組Ⅰ)與粗纖維降解劑(試驗組Ⅲ)處理后能顯著降低紫蘇秸稈飼料中的中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)的含量(P<0.05)，而試驗組Ⅳ處理后的變化不大(P>0.05)，但4種處理方法均能顯著降低發(fā)酵飼料的酸性洗滌木質素(ADL)的含量(P<0.05)。

2.2 紫蘇秸稈發(fā)酵飼料的現(xiàn)場感官評定

不同處理之間紫蘇秸稈發(fā)酵飼料的感官評價差異明顯(P<0.05)，且采用強微99生酵劑+粗纖維降解劑+里氏木霉發(fā)酵液混合發(fā)酵或每種單一發(fā)酵后的感官評價等級均為良好，但混合發(fā)酵的總體評分最高(27.39)，等級為良好，而單純添加里氏木霉發(fā)酵液發(fā)酵后的紫蘇秸稈飼料總體評分較低，等級為一般。

2.3 紫蘇秸稈發(fā)酵飼料的發(fā)酵品質

各試驗組的pH顯著低于對照組(P<0.05)(表4)，試驗組Ⅱ與試驗組Ⅲ之間的差異不顯著(P>0.05)；試驗組Ⅰ的氨態(tài)氮/總氮、乙酸、丙酸和丁酸的含量均顯著低于對照組和試驗組Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ(P<0.05)，且對照組最高。

表2 不同處理方法下紫蘇秸稈發(fā)酵飼料的營養(yǎng)成分Table 2 Nutrients content of Perilla frutescens fermentation straw by different method %

試驗組Ⅰ,添加20%玉米粉+1 g·kg-1強微99生酵劑+1 g·kg-1粗纖維降解劑+50 mL·kg-1里氏木霉發(fā)酵液;試驗組Ⅱ,添加20%玉米粉+1 g·kg-1強微99生酵劑;試驗組Ⅲ,添加20%玉米粉+1 g·kg-1粗纖維降解劑;試驗Ⅳ,(添加20%玉米粉+50 mL·kg-1里氏木霉發(fā)酵液;CK，對照；同列不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，下同。

Group Ⅰ, adding 20% corn flour+1 g·kg-1Qiangwei 99 starter cultures +1 g·kg-1crude fiber degradation agent + 50 mL·kg-1Trichoderma fermentation solution; Group Ⅱ, adding 20% corn flour +1 g·kg-1Qiangwei 99 starter cultures; Group Ⅲ, adding 20% corn flour+1 g·kg-1crude fiber degradation agent; Group Ⅳ, adding 20% corn flour + 50 mL·kg-1Trichoderma fermentation solution; CK, control; Different lowercase letters within the same column means significant difference at the 0.05 level, and the same letters indicate no significant difference at the 0.05 level; similarly for the following tables.

表3 紫蘇秸稈發(fā)酵飼料感官評定Table 3 Sensory score of Perilla frutescens fermentation straw

表4 蘇秸稈發(fā)酵飼料的發(fā)酵品質Table 4 Fermentation quality of Perilla frutescens straw

表5 紫蘇秸稈發(fā)酵飼料V-score 評分結果Table 5 The V-score of Perilla frutescens fermentation straw

2.4 紫蘇秸稈發(fā)酵飼料品質評分結果

按照V-score評分標準，不同處理方式下對照組、試驗組Ⅲ、Ⅳ的發(fā)酵品質評分較低，評價等級為差(Y<60)，且試驗組Ⅳ的V-Score評分僅為39.77分；試驗組Ⅰ、Ⅱ的評價等級均為良，但試驗組Ⅰ的評分最高，說明其發(fā)酵效果最好(表5)。

3 討論

3.1 不同處理對紫蘇秸稈發(fā)酵飼料營養(yǎng)成分的影響

農作物秸稈細胞壁中因含有一些特殊的木質素、纖維素及半纖維素復合體等物質，限制了草食動物對其的消化吸收及利用，進而阻礙了秸稈細胞內營養(yǎng)物質的釋放，導致在直接飼喂過程中家畜的消化利用率低，適口性差且商品化程度低。因此，探索一種經濟、安全、高效的農作物秸稈飼料化處理方法，將對我國農業(yè)和畜牧業(yè)的持續(xù)、穩(wěn)定、快速發(fā)展具有非常重要的現(xiàn)實意義[22]。紫蘇作為我國衛(wèi)生部首批公布的藥食同源植物，也是我國傳統(tǒng)的多用途經濟植物，具有十分重要的應用價值[23]，但紫蘇的副產品——秸稈因沒有引起人們的興趣和重視，在生產中要么被就地焚燒掉，要么被因遺棄腐爛而白白浪費掉，這不僅造成了生態(tài)環(huán)境的污染，也導致有效的農業(yè)資源未能得到合理的開發(fā)利用[24]。而紫蘇秸稈之所以未被很好地用于動物日糧的飼料來源和有效補充，主要原因在于其秸稈的質地粗硬，粗纖維含量過高而導致其適口性較差。因此，如何通過技術手段和現(xiàn)有的研究方法，降低紫蘇秸稈的粗纖維含量，提高其在飼用時的營養(yǎng)成分，改善適口性，從而提高紫蘇秸稈在動物飼料利用中的表觀消化率和營養(yǎng)成分利用率，是解決紫蘇秸稈飼料化利用過程中的關鍵所在。

目前，利用生物技術發(fā)酵制備秸稈飼料的方法主要有秸稈微貯、利用復合酶制劑和菌酶制劑直接發(fā)酵秸稈以及利用秸稈生產單細胞蛋白質等[25]。而酶法和微生物法[26-27]作為目前國內外研究表明行之有效的秸稈飼料化處理方法，用此法處理后得到的秸稈飼料，不僅粗纖維含量下降，適口性得到有效改善，而且粗蛋白、粗脂肪等營養(yǎng)物質進一步提高。用木霉與酵母混合發(fā)酵處理后的玉米(Zeamays)秸稈飼料，可使其粗蛋白含量從4.2%提高到19.7%，粗纖維含量從36.2%下降到24.1%[28]；利用復合益生菌發(fā)酵處理后的鮮食大豆(Glycinemax)秸稈飼料，其中的Ash、Ca、P、乳酸菌及乳酸等含量顯著提高，而CF、NDF、ADF等限制因子也明顯降低，從而使發(fā)酵飼料品質得到明顯改善[29]；強微無抗飼料發(fā)酵劑發(fā)酵藥渣飼料后能明顯改善飼料的適口性，提高羊的采食量[30]。本研究表明，采用強微99生酵劑+粗纖維降解劑+木霉發(fā)酵液混合發(fā)酵紫蘇秸稈能顯著提高秸稈飼料的CP、EE的含量，明顯降低CF、ADF、NDF及ADL的含量，從而提升發(fā)酵飼料的感官與品質評分，進而改善發(fā)酵品質。同時，上述處理方法主要是通過添加菌制劑和酶制劑，降低秸稈中纖維素、半纖維素和木質素的含量，改善秸稈微貯飼料的品質和營養(yǎng)成分，提高其有氧穩(wěn)定性。有研究表明，酶菌混合處理后的玉米秸稈pH 和可溶性糖(water soluble sugar,WSC)顯著降低，CP含量提高，NDF、ADF、ADL含量顯著低于單一處理及對照組[31]，而利用商業(yè)秸稈發(fā)酵劑、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌和酵母菌發(fā)酵玉米秸稈，發(fā)酵后CP含量增加1.068倍，CF、NDF及ADF含量分別降低20.15%、58.83%和42.32%[32]。本研究中，經過不同粗纖維降解發(fā)酵劑處理后的紫蘇秸稈，與對照組相比，4個試驗組的CF和ADL的含量顯著降低(P<0.05)，CP和EE的含量顯著升高(P<0.05)，與大多數的研究結果一致[33-34]，即利用不同粗纖維降解劑處理紫蘇秸稈后制備成的紫蘇秸稈發(fā)酵飼料營養(yǎng)價值明顯得到改善，表明采用粗纖維降解劑降解紫蘇秸稈中的粗纖維后，再通過發(fā)酵處理制備成飼料具有理論上的可行性。

3.2 不同處理方式對紫蘇秸稈發(fā)酵飼料品質的影響

V-score發(fā)酵飼料評分體系是以氨態(tài)氮與乙酸、丙酸及丁酸等揮發(fā)性脂肪酸的含量為指標進行各項分數計算和發(fā)酵飼料的品質評價的，利用該評定體系可以相對客觀地反映發(fā)酵飼料的品質[19]。本研究表明：經過不同降解劑降解發(fā)酵處理后的紫蘇秸稈發(fā)酵飼料，試驗組Ⅲ、Ⅳ的發(fā)酵品質評分較低，評價等級為差(Y<60)，且試驗組Ⅳ的V-Score評分僅為39.37分；試驗組Ⅰ、Ⅱ的評價等級均為良，其中試驗組Ⅰ的評分最高(V-Score=75.51)，說明其發(fā)酵效果最好。而作為秸稈發(fā)酵的關鍵指標，有機酸含量高低不僅決定了飼料的適口性，而且對發(fā)酵品質的影響至關重要[35]，其中最重要的是乳酸、乙酸和丁酸的含量，經腐敗菌等有害微生物分解蛋白質、葡萄糖和乳酸后所產生的重要產物——丁酸，其含量越低，則飼料中有害微生物的活性也越低，發(fā)酵品質就越好[20]。同時，在秸稈飼料發(fā)酵過程中，作為評價發(fā)酵飼料品質好壞的重要觀測指標[36-37]，氨態(tài)氮與總氮的比值越高，蛋白質與氨基酸的分解就越多，發(fā)酵飼料的品質就越差。而pH作為影響微生物生長的關鍵因素，較低的pH能夠顯著提高乳酸菌的含量，降低氨態(tài)氮和丁酸含量，從而抑制其他有害菌的生長，提高發(fā)酵飼料的品質，如在青貯玉米秸稈發(fā)酵過程中，當pH降為3.8～4.2時，大多數菌的生長均不能進行繁殖[38]。本研究中，不同條件微生物發(fā)酵劑均能顯著降低紫蘇秸稈發(fā)酵飼料的pH和氨態(tài)氮∶總氮，且混合發(fā)酵處理的效果最好。顧擁建等[39]采不同處理方式對蠶豆(Viciafaba)秸稈發(fā)酵結果表明，在青貯蠶豆秸稈中添加20%麩皮+40 g·t-1乳酸菌+ 400 g·t-1纖維素酶能夠顯著降低pH和氨態(tài)氮/總氮的比值，改善發(fā)酵秸稈飼料的品質。本研究中，經混合發(fā)酵方法(試驗組Ⅰ)處理的紫蘇秸稈，其氨態(tài)氮/總氮、乙酸、丙酸和丁酸的含量均顯著低于其他試驗組，表明此種方法作為紫蘇秸稈飼料化處理的手段具有理論和實踐意義上的可操作性。

4 結論

紫蘇作為我國衛(wèi)生部首批公布的藥食同源植物和傳統(tǒng)的多用途經濟植物，具有十分重要的實際應用價值。本研究采用市售的強微99生酵劑、粗纖維降解劑及里氏木霉發(fā)酵液混合發(fā)酵處理制備成的紫蘇秸稈飼料，其發(fā)酵飼料的品質均能不同程度地得到改善，飼料中的CF、ADF、NDF及有機酸含量明顯降低，CP和EE的含量明顯提高。因此，可以作為紫蘇秸稈飼料化利用的微生物發(fā)酵劑進行推廣。且在發(fā)酵溫度為30 ℃，發(fā)酵時間為7 d的條件下，在紫蘇秸稈中添加20%玉米粉+1 g·kg-1強微99生酵劑+1 g·kg-1粗纖維降解劑+50 mL·kg-1里氏木霉發(fā)酵液混合處理后得到的發(fā)酵飼料品質最佳。

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