姬麗婭 馬妮 王新來 狄政莉 史明 李三中 吳中亮*

(空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院: 1神經(jīng)內(nèi)科; 2神經(jīng)外科，陜西 西安710032; 3西安市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 西安710003)

膠質(zhì)瘤因其惡性增殖、免疫逃逸、超強的侵襲和轉(zhuǎn)移能力、放化療抵抗和膠質(zhì)瘤干細胞的自我更新，使得膠質(zhì)瘤尤其是惡性膠質(zhì)母細胞瘤的術(shù)后生存時間很短，已嚴重危害人類健康。如何針對膠質(zhì)瘤細胞的以上特點，找出快速有效的治療策略成為治療膠質(zhì)瘤的關(guān)鍵所在。本研究主要觀察miR-144-3p分子在膠質(zhì)瘤中的表達。

材料與方法

一、材料

1.細胞系：實驗所需人源神經(jīng)元細胞系HCN-2、U251膠質(zhì)瘤細胞系、U87MG膠質(zhì)瘤細胞系均購自ATCC細胞庫，并在論文撰寫人所在實驗室傳代保存。

2.標本收集：本實驗所需膠質(zhì)瘤組織均來自于西京醫(yī)院神經(jīng)外科膠質(zhì)瘤患者，共30例，其中彌散性星形細胞瘤(WHO Ⅰ或Ⅱ級)共10例，間變性星形細胞瘤(WHO Ⅲ級)共10例，原發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤(WHO Ⅳ級)共10例。正常腦組織樣本均來自西京醫(yī)院神經(jīng)外科的腦外傷患者切除組織，共30例。所有標本處理均根據(jù)西京醫(yī)院的倫理和法律標準，所有參與者均簽署知情同意書。

3.實驗試劑及來源：RPMI-1640(Roswell Park Memorial Institute-1640)，DMEM ( Dulbecco's modified Eagle's medium)，胰蛋白酶，PBS(磷酸緩沖鹽溶液，phosphate buffer saline, PBS)均購置于GIBCO公司；胎牛血清購于杭州四季青；Trizol購于Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑，實時定量PCR試劑盒購于Takara公司。

4.實驗所用主要儀器及生產(chǎn)公司：PCR擴增儀購置于BioRad公司；組織勻漿器，瓊脂糖凝膠電泳儀購于北京市六一儀器廠；超凈工作臺購于蘇凈集團安泰公司；電子天平購于Mettler-Tollede公司；超純水制備器購于Millipore公司；紫外凝膠成像儀購于Alpha Innotech公司；臺式高速低溫離心機購于Beckman；生物安全柜購于Nuaire公司；恒溫孵箱購于Thermo公司；實時定量PCR儀購于ABI公司；相差顯微鏡購于Olympus BX-51公司。

5.實時定量PCR引物序列：miR-144-3p基因引物序列為5'-TACAGTATAGATGATGTACT-3'。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)及miRNA轉(zhuǎn)染：U87MG和U251細胞系培養(yǎng)：復(fù)蘇：將凍存的U87MG或U251細胞系在37 ℃水浴鍋中迅速融化解凍，一邊解凍一邊輕輕晃動凍存管，使其均勻受熱；在無菌的超凈工作臺中，將解凍后的細胞小心轉(zhuǎn)移至離心管中，加入10 mL經(jīng)37 ℃水浴鍋預(yù)熱的RPMI-1640培養(yǎng)液( Roswell Park Memorial Institute-1640)，小心、充分混勻；將細胞放入臺式離心機中，12 000 r/min，離心5 min；離心完成后，在超凈工作臺中將上清培養(yǎng)液移除，用新鮮RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細胞團塊，小心吹打數(shù)次至單細胞懸液，將細胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中；將復(fù)蘇后的細胞置于5% CO2、37 ℃恒溫孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。細胞傳代：每天觀察細胞生長密度和培養(yǎng)基顏色變化，當細胞鋪滿培養(yǎng)皿底部時，即需要傳代處理，約每3 d傳代一次；當細胞需要傳代時，小心將培養(yǎng)液吸出，加入2～3 mL無菌PBS，輕輕清洗細胞后，移除PBS；在10 cm培養(yǎng)皿中加入1～2 mL左右胰蛋白酶，放置于孵箱中消化約3～5 min，并實時觀察細胞消化情況；在培養(yǎng)皿中加入2～3 mL含血清培養(yǎng)液終止消化，吹打均勻后，將細胞懸液移至15 mL離心管中，12 000 r/min，離心5 min；離心完成后，在超凈工作臺中將上清培養(yǎng)液移除，用新鮮RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細胞團塊，小心吹打數(shù)次至單細胞懸液，將細胞按1 ∶4比例繼續(xù)接種于10 cm培養(yǎng)皿中。

2.細胞及組織RNA提取：收取大約數(shù)量為1×106的膠質(zhì)瘤細胞，并加入1 mL TRIzol(Invitrogen)對細胞進行消化液裂，室溫靜置約5 min以防止染色質(zhì)-蛋白復(fù)合物形成，靜止后將裂解液移入1.5 mL離心管中；若樣本為腫瘤組織，則取小塊組織(約0.1 g)，加入1 mL TRIzol后，用組織勻漿器進行研磨，待組織完全磨碎后，將裂解液小心吸取移入1.5 mL離心管中；在離心管中加入五分之一體積(200 μL)氯仿，蓋緊蓋子，將離心管置于斡旋震蕩儀上劇烈震動混勻15 s后，室溫靜置2 min；將油相、水相分層的裂解液置于低溫離心機中，轉(zhuǎn)速12 000 r/min，4 ℃離心15 min；離心后溶液徹底分層，使用無RNA酶的槍頭小心吸取上層水相(無色透明狀)，并轉(zhuǎn)入干凈無RNA酶的1.5 mL離心管中，加入二分之一體積(500 μL)異丙醇，輕柔上下顛倒，使之充分混勻同時避免劇烈晃動致使染色質(zhì)斷裂；4 ℃靜置10 min后，置于離心機中，轉(zhuǎn)速12 000 r/min，4 ℃低溫離心10 min；離心后可見離心管底部膠狀無色沉淀，棄去廢液，加入大約800 μL濃度為70%～75%乙醇進行洗滌，洗滌后進行離心，7 500 r/min，4 ℃低溫離心5 min；棄去廢液，并將離心管倒扣于干凈濾紙上，至乙醇全部控干揮發(fā)后，加入50 μL體積無RNA酶水進行溶解并定量，放于-70 ℃保存。

3.反轉(zhuǎn)錄PCR：將miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒所包含試劑進行冰上融解，上下輕柔顛倒使之混勻，短暫離心后將試劑放置冰上待用；將已進行定量的RNA樣本取出，根據(jù)濃度計算所要加入的RNA的體積(反轉(zhuǎn)質(zhì)量約為1～5 μg)，反應(yīng)體系配制為2×Reaction Buffer 10 μL，Primer(引物) 1 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，RNA 1～5 μg，RNase Free (無RNA酶)H2O補足20 μL，總量為20 μL混勻配制完成的反應(yīng)混合液，將PCR管短暫離心后，放于PCR擴增儀中，反應(yīng)條件如下：37 ℃反應(yīng)60 min，85 ℃反應(yīng)5 s滅活處理，所得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可使用滅菌雙蒸水稀釋5～10倍后，放于-20 ℃保存。實驗中所使用到移液器吸頭和不同規(guī)格離心管，均需要提前使用濃度0.1%焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate, DEPC)溶液浸沒過夜，并經(jīng)高壓滅菌、烘干后方可使用。

4.實時定量PCR：將實時定量PCR所需試劑置于冰上融解，上下輕柔顛倒使之混勻，短暫離心后將試劑放置冰上待用；按照說明書要求，冰上配制實時定量PCR反應(yīng)液，體系如下：SYBR mix 10 μL，ROX 0.4 μL，10 nM miRNA Primer 0.8 μL，10 nM Common Primer 0.8 μL，cDNA 1 μL，RNase Free H2O 7 μL共20 μL混勻配制完成的實時定量PCR反應(yīng)混合液，按順序加入至PCR反應(yīng)八聯(lián)管中，短暫離心后，將八聯(lián)管放于實時定量PCR擴增儀中。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min后，進入循環(huán)；循環(huán)內(nèi)95 ℃變性30 s，60 ℃反應(yīng)延伸35 s，重復(fù)40個循環(huán)。檢測miR-144-3p分子的表達量(Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA)，U6作為內(nèi)參對照。

結(jié) 果

一、miR-144-3p分子在膠質(zhì)瘤患者不同組織中的表達差異

30例腦外傷患者切除的部分組織、30例不同病理學分級膠質(zhì)瘤患者的癌和癌旁組織。將不同樣品提取RNA后，檢測miR-144-3p分子基因的表達水平。檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-144-3p在正常腦組織中表達最高，癌旁組織中的水平高于癌組織。這提示在膠質(zhì)瘤組織中miR-144-3p的豐度占優(yōu)勢，可能會發(fā)揮更重要的作用(圖1)。結(jié)果提示，miR-144-3p分子在不同組織中存在明顯的表達差異。

二、miR-144-3p分子在不同病理學分級膠質(zhì)瘤中的表達差異

將50例膠質(zhì)瘤患者的組織標本按照其病理學分級進行了分組，分別為5例WHO Ⅰ級膠質(zhì)瘤，5例WHO Ⅱ級膠質(zhì)瘤，10例WHO Ⅲ級膠質(zhì)瘤和10例WHO Ⅳ級膠質(zhì)瘤。并在四組之間miR-144-3p的表達量做進一步統(tǒng)計學分析。結(jié)果如圖2所示，miR-144-3p在病理學分級較低的Ⅰ或Ⅱ級膠質(zhì)瘤中高水平表達，而在Ⅲ級膠質(zhì)瘤中表達豐度較低，在Ⅳ級膠質(zhì)瘤中表達最弱，這也與之前觀察檢測的結(jié)果相一致，miR-144-3p在腫瘤組織中低表達，并隨著惡性程度增加而逐漸降低。

三、miR-144-3p分子在不同人源膠質(zhì)瘤細胞系中的表達差異

為了進一步驗證我們的結(jié)論，我們選取了不同人源膠質(zhì)瘤細胞系和正常神經(jīng)元細胞系，對該miRNA簇的不同分子表達水平進行鑒定檢測。miR-144-3p在正常神經(jīng)元細胞系中表達都遠高于各組神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系(圖3)。這提示，miR-144-3p分子與膠質(zhì)瘤的進展密切相關(guān)，有可能參與調(diào)控膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展。

四、miR-144-3p的表達量與患者預(yù)后相關(guān)性

將膠質(zhì)瘤患者的術(shù)后生存期與miR-144-3P表達水平進行了生存分析，結(jié)果提示，miR-144-3p的表達水與膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后呈正相關(guān)(圖4)。這提示miR-144-3P分子可能在膠質(zhì)瘤的進展中發(fā)揮重要作用。

圖1 miR-144-3p在不同組織中的表達情況

Fig 1 miR-144-3p was differentially expressed in normal tissues and glioma tissues

aP<0.001,vstumor group;bP<0.001,vsadjacent group;cP<0.001,vstumor group.

圖2 miR-144-3p在不同病理學分級膠質(zhì)瘤中的表達

Fig 2 Expression levels of miR-144-3p in the different grades of glioma

aP<0.001,vsGrade Ⅳ;bP<0.001,vsGrade Ⅲ;cP<0.001,vsGrade Ⅳ;dP<0.05,vsGrade Ⅲ;eP<0.05,vsGrade Ⅳ.

圖3 miR-144-3p在正常神經(jīng)元和膠質(zhì)瘤細胞系中的表達

Fig 3 Expressions of miR-144-3p in HCN-2, U251 and U87MG

aP<0.001,vsnormal tissue group;bP<0.001,vsnormal tissue group.

圖4 miR-144-3p分子與膠質(zhì)瘤患者術(shù)后生存期相關(guān)性

Fig 4 The levels of miR-144-3p were positively related to the survival days in patients with glioma

aP<0.001,vslow grade group.

討 論

目前，在哺乳動物中現(xiàn)已被發(fā)現(xiàn)證實的miRNAs多達1 000條以上，其中多數(shù)為高度保守[1-3]。每一種miRNAs都有幾個到幾十個不同數(shù)量的下游靶基因，而同一個基因又往往受到不同的miRNAs的共同調(diào)控[1-4]。人類轉(zhuǎn)錄組中超過三分之一的轉(zhuǎn)錄本都會在不同時期受到miRNsA的轉(zhuǎn)錄后修飾。值得注意的是，從初始miRNAs的轉(zhuǎn)錄，到Drosha酶的切割形成前體miRNAs，再到Dicer酶的水解形成成熟miRNAs，每一個步驟都存在嚴密而精準的調(diào)控過程[2-8]。miRNAs和不同靶基因之間存在競爭性的調(diào)控關(guān)系，在不同組織、不同細胞以及不同狀態(tài)下，由于其基因表達譜的差異，同一種miRNAs主要調(diào)控的靶基因不盡相同。正是由于miRNAs表達的精密調(diào)控和對靶基因的動態(tài)作用，使得miRNAs作為重要的表觀遺傳學調(diào)控因素，在諸如細胞增殖、細胞運動、定向發(fā)育、非對稱性發(fā)育等多種細胞學行為中發(fā)揮調(diào)控作用[8-11]。

在本課題的研究中，我們發(fā)現(xiàn)，miR-144-3p與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，并隨著其惡性分級的升高，表達逐步降低。在細胞系水平進行的體外實驗也同樣證實這一點。這些結(jié)果提示我們，miR-144-3p可能會參與膠質(zhì)瘤的調(diào)控中，并且有可能作為早期診斷的分子預(yù)警標志、臨床治療的潛在靶點以及患者預(yù)后的參考標志。

在實驗中，我們還發(fā)現(xiàn)miR-144-3p與miR-451a分子簇在染色質(zhì)定位上彼此相距較近，僅相隔不到100 bp左右，很有可能擁有相同的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。在基因組中，有的miRNAs位于編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄本內(nèi)含子中，會跟隨宿主基因的轉(zhuǎn)錄一同被轉(zhuǎn)錄，而后在轉(zhuǎn)錄后剪切的過程中，前體miRNAs被成功剪切出來。而有的miRNAs則位于不同基因之間的區(qū)域，這些miRNAs往往具有獨立的啟動子區(qū)域和調(diào)控序列[12-13]。很顯然，miR-144-3p/miR-451a分子簇就屬于后者。我們進一步的一系列實驗均證實，miR-144-3p和miR-451a在不同樣本之間的表達趨勢均存在較好的一致性，且其兩兩之間表達水平也具有相關(guān)性。因此，很有可能miR-144-3p/miR-451a擁有共同的初始轉(zhuǎn)錄本，由于研究時間和深入程度有限，在本課題中未能解決該問題。然而這個問題卻具有很強的臨床意義，miR-144-3p在膠質(zhì)瘤中表達降低的機制未明，極有可能是上游調(diào)控該分子簇的轉(zhuǎn)錄因子表達變化或者活性改變所致。因此，進一步研究miR-144-3p的轉(zhuǎn)錄起始位點對于闡明miR-144-3p在膠質(zhì)瘤中的作用貢獻、調(diào)控機制以及進一步的靶向治療顯得同樣重要，這也是該課題下一步的方向之一。

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