朱 昊 ，張 博 ，張薈薈 ，王玉祥 ，柯 梅 ，李學(xué)森 *

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院草業(yè)研究所，烏魯木齊 830011）

我國的牧草種質(zhì)資源極為豐富，目前的研究主要集中在以全球變化與農(nóng)業(yè)多樣性、農(nóng)業(yè)系統(tǒng)固碳減排、草地農(nóng)業(yè)決策系統(tǒng)及林草生態(tài)等宏觀方面[1]；同時(shí)以分子生物學(xué)為基礎(chǔ)的微觀方面也有許多研究，主要包括DNA水平上的遺傳多樣性和分子標(biāo)記輔助選擇育種等方面[2-3]。利用新一代高通量測序技術(shù)進(jìn)行牧草種質(zhì)資源創(chuàng)新及抗逆基因挖掘方面的研究相對較少[4]。

1 RNA-seq技術(shù)原理

RNA-seq即轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)。克里克（Francis Harry Compton Crick,1916-2004）于1958年提出“中心法則”，并于1970年在Nature上的一篇文章中進(jìn)行了重申。中心法則指出遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再從RNA傳遞給蛋白質(zhì)，即完成遺傳信息的轉(zhuǎn)錄和翻譯的過程。依據(jù)中心法則，隨著二代測序技術(shù)的興起和成熟，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究得到了蓬勃發(fā)展。簡而言之，轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）就是從RNA水平研究基因表達(dá)的情況，是一門在整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學(xué)科。

轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）廣義上指某一生理?xiàng)l件下，細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的集合，包括mRNA、rRNA、tRNA及Non-coding RNA；狹義上指所有mRNA的集合。 RNA-seq，就是把mRNA、small RNA及Noncoding RNA等或者其中一些用高通量測序技術(shù)把它們的序列測出來。反映出它們的表達(dá)水平。不管物種有無基因序列信息，該技術(shù)都能夠全面檢測其所有基因的表達(dá)，具有通量高、成本低、定量準(zhǔn)、靈敏度高、重復(fù)性好以及檢測范圍廣等特點(diǎn)。

2 RNA-seq一般流程

轉(zhuǎn)錄組測序分析技術(shù)的流程如下（圖1）。

圖1 轉(zhuǎn)錄組測序及后續(xù)生物信息學(xué)分析流程圖

轉(zhuǎn)錄組測序需要注意的事項(xiàng)：（1）取樣，每個(gè)處理至少得有3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，這個(gè)對于無參考基因組序列更為重要；（2）RNA的抽提檢測，理想的RNA樣品是試驗(yàn)取得成功的一切的前提；（3）測序得到Uigene序列后的生物信息學(xué)分析是關(guān)鍵，結(jié)合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的目的對數(shù)據(jù)進(jìn)行深度挖掘。

3 植物應(yīng)答環(huán)境脅迫方面的RNA-seq研究

植物對逆境脅迫的應(yīng)答是通過細(xì)胞分子水平修飾、自身的生理生化改變來順應(yīng)不利的生存環(huán)境?；虮磉_(dá)具有時(shí)空性，抗逆基因的表達(dá)尤其明顯。對植物的不同組織器官、不同生長發(fā)育階段、不同環(huán)境脅迫因子響應(yīng)時(shí)的差異表達(dá)的基因進(jìn)行分析篩選，挖掘關(guān)鍵基因和抗性之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系，將有助于從轉(zhuǎn)錄水平上了解脅迫因子的傷害機(jī)理及植物適應(yīng)逆境脅迫的分子機(jī)制。

3.1 溫度脅迫

溫度是植物生長發(fā)育過程中十分重要的環(huán)境影響因子。溫度脅迫引起植物生理上的變化主要體現(xiàn)在光合作用、細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抗氧化物質(zhì)等方面。吳月燕等［5］以杜鵑為研究材料，人工模擬低溫脅迫，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序以探索杜鵑抗寒的分子機(jī)制。從頭測序組裝得到Unigenes序列122 654個(gè)，有大量的Unigenes注釋到同源數(shù)據(jù)庫中，部分Unigenes未得到數(shù)據(jù)庫的注釋信息，這可能是杜鵑的特有的基因序列。其轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果表明，差異表達(dá)的基因共有10 829個(gè)，這些差異基因?yàn)榻沂径霹N抗寒機(jī)理，提供了大量可靠的轉(zhuǎn)錄組水平的基本研究數(shù)據(jù)，還有待后續(xù)研究的進(jìn)一步挖掘分析。顏朗等［6］通過比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，初步揭示了低溫處理下皇竹草的抗寒分子機(jī)制。篩選出冬夏兩季皇竹草差異表達(dá)基因11 443個(gè)，挖掘到在冬季低溫條件下高度表達(dá)的耐寒基因112個(gè)，且17個(gè)耐寒基因在冬季低溫材料中特意表達(dá)。韓超等［7］研究了梭梭對高溫脅迫的轉(zhuǎn)錄組響應(yīng)情況，分析了差異表達(dá)基因的功能和蛋白代謝通路，結(jié)果表明，梭梭的同化枝在應(yīng)答高溫單一環(huán)境因子脅迫時(shí)，多個(gè)基因、多個(gè)生物過程協(xié)同調(diào)控。因此，溫度這個(gè)單一的環(huán)境因子變化引起梭梭啟動(dòng)多基因表達(dá)系統(tǒng)來應(yīng)答。

3.2 干旱脅迫

水是生命之源。在干旱脅迫下，植物體通過改變自身組織器官的生理生化狀態(tài)來適應(yīng)不利的生存環(huán)境[8]。植物對干旱脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制通常是通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、以不同代謝通路上的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯來調(diào)控應(yīng)答。周炎等[9]分析了烤煙品系LY1360在干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄組，通過GO和KEGG分析比較干旱脅迫下供試材料的基因和代謝通路差異，結(jié)果表明激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)鍵基因在干旱脅迫下表達(dá)量均顯著上調(diào)。張春榮等[10]對干旱脅迫下的甘草根進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，發(fā)現(xiàn)適度干旱促進(jìn)抗逆相關(guān)基因的表達(dá)和甘草根有效成分積累。GO富集分析顯示天冬酰胺酰內(nèi)肽酶、β-木糖苷酶、GDP-L-巖藻糖合酶基因下調(diào)并顯著富集，這表明干旱脅迫可能抑制干草根初生壁的降解與程序性細(xì)胞死亡。孫愛清等［11］對花生干旱處理前后轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜變化進(jìn)行了分析比較，篩選出935個(gè)差異表達(dá)基因，其中323個(gè)基因涉及次生代謝、大分子代謝、能量代謝等代謝途徑。在干旱脅迫條件下參與類黃酮代謝途徑的9個(gè)基因的表達(dá)量均顯著上調(diào)，推斷花生在干旱脅迫下類黃酮對抵御干旱起到十分重要的作用。

3.3 鹽脅迫

鹽脅迫對植物生長的威脅是干旱之外的第二大環(huán)境因子脅迫。有關(guān)農(nóng)作物及鹽生植物對鹽脅迫的轉(zhuǎn)錄組研究相對比較深入，現(xiàn)已鑒定出部分相關(guān)耐鹽基因，涉及到多個(gè)代謝途徑。吉福桑等［12］研究了巴西蕉葉片在中性單鹽NaCl脅迫下的轉(zhuǎn)錄組情況，結(jié)果表明脅迫12 h差異基因的上調(diào)和下調(diào)表達(dá)數(shù)均高于脅迫24 h。KEGG分析表明差異基因主要涉及類酮類和丙酮素生物合成途徑以及光合作用等代謝通徑。qRT-PCR驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可靠可信，為香蕉耐鹽機(jī)理分析提供了科學(xué)參考依據(jù)。彭振等［13］以耐鹽和敏鹽的陸地棉為研究材料，分別研究2個(gè)材料在NaCl鹽脅迫下幼苗葉片的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況。通過差異基因篩選，鑒定出26個(gè)與耐鹽相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族，高表達(dá)的11個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因與陸地棉的耐鹽密切相關(guān)。張麗麗［14］以荒漠鹽堿地常見的鹽生植物鹽穗木為研究材料，分別對在低鹽和高鹽下脅迫3 h的同化枝進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序。篩選出高鹽和低鹽脅迫下共差異基因1 254個(gè)，有關(guān)滲透調(diào)節(jié)和活性氧清除的基因大多表現(xiàn)為上調(diào)基因，說明鹽穗木在短期鹽脅迫下以增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)和活性氧清除為應(yīng)答策略。

4 RNA-seq在牧草抗逆基因挖掘中的研究現(xiàn)狀

張純（2017）[15]梳理了許多植物在逆境脅迫下的轉(zhuǎn)錄組應(yīng)答的研究報(bào)告，發(fā)現(xiàn)主要集中在水稻、棉花、玉米、大豆、馬鈴薯、丹參、黃瓜、牡丹等這些作物和藥用植物及花卉植物方面；有關(guān)牧草植物的研究相對少，僅見星星草、高羊茅及紫羊茅等物種。郭云（2016）[16]基于RNA-seq技術(shù)研究了苜蓿根蘗性狀發(fā)生的下調(diào)基因情況。齊曉（2017）[17]對低溫脅迫下苜蓿轉(zhuǎn)錄因子的鑒定和表達(dá)進(jìn)行了分析。Zhipeng Liu（2013）[18]在國外報(bào)到了同源四倍體紫花苜?！敖鸹屎蟆睆姆N子萌發(fā)到開花生長發(fā)育的階段的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)情況，基于此轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開發(fā)了紫花苜蓿的EST-SSR分子標(biāo)記引物。此外，冷暖（2017）[19]研究報(bào)到了草地早熟禾在干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄組應(yīng)答。通過查閱文獻(xiàn)可知，目前國內(nèi)有關(guān)牧草的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究相對滯后，即使作為牧草之王的紫花苜蓿在轉(zhuǎn)錄組方面的研究也很少。

5 展 望

牧草種質(zhì)資源的挖掘大多集中于優(yōu)良抗性種質(zhì)篩選方面，相對作物來講，有關(guān)基因資源分子水平的研究起步晚、研究相對比較淺，有關(guān)抗性基因的分析很少。隨著二代測序成本的進(jìn)一步下降及三代測序的興起，通過RNA-seq技術(shù)在牧草優(yōu)良種質(zhì)資源基因挖掘方面的應(yīng)用前景十分廣闊。

此外，轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以結(jié)合代謝組學(xué)和蛋白組學(xué)一起來研究，多組學(xué)的關(guān)聯(lián)可為牧草種質(zhì)資源挖掘和優(yōu)良基因克隆及抗逆機(jī)制等方面提供分子水平研究的大數(shù)據(jù)平臺(tái)。

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