黃李勇，趙 雄，曼則熱·朱爾丁，吐爾遜阿依·牙力坤，依明·蘇來曼

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

黑素皮質(zhì)素受體-4（melanocortin-4 receptor）廣泛存在于動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的各個區(qū)域，是下丘腦腹內(nèi)側(cè)核分泌的一種肽類物質(zhì)[1]，MC4R是G-蛋白偶聯(lián)受體超家族成員之一，可以通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)控制哺乳動物的攝食量、能量穩(wěn)態(tài)和體重，是一個調(diào)控動態(tài)平衡和能量平衡的重要信號分子，在馬和豬等哺乳動物中主要影響采食、增重和脂肪等性狀[2]。MC4R是黑素皮質(zhì)素系統(tǒng)最主要的成員，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能主要表現(xiàn)為抑制哺乳動物攝食，導(dǎo)致血糖和胰島素水平降低，從而減少體內(nèi)脂肪，降低體重。因此在研究人類肥胖和哺乳動物生長過程中，MC4R基因作為重要的調(diào)節(jié)因子倍受關(guān)注[3]。

巴什拜羊是上世紀(jì)初期，新疆塔城地區(qū)著名愛國民主人士巴什拜·喬拉克·巴平從地方品種哈薩克羊中選出優(yōu)良母羊作為母本，并嚴(yán)格選育優(yōu)良種公羊，同時導(dǎo)入野生盤羊進(jìn)行雜交改良，通過牧民及科研工作者的長期選育形成的地方優(yōu)良品種[4]。具有生長發(fā)育速度快，產(chǎn)肉性能高，適應(yīng)性強等特點。原產(chǎn)于塔城裕民縣的巴爾魯克山區(qū)[5]，現(xiàn)今主要分布在塔城地區(qū)的裕民縣、額敏縣和托里縣等地。截止2014年新疆巴什拜羊存欄總數(shù)已達(dá)150萬只[6]。目前，關(guān)于新疆巴什拜羊生長發(fā)育和肉質(zhì)等性狀候選基因的標(biāo)記輔助選擇研究報道較少。本研究對巴什拜羊MC4R基因進(jìn)行多態(tài)性分析，探討其多態(tài)性與生長指標(biāo)的關(guān)系，以期為巴什拜羊分子標(biāo)記育種提供有力的科學(xué)依據(jù)。

1 試驗材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣本選擇

血液樣本來自于新疆塔城裕民縣巴什拜羊繁育基地，隨機(jī)選取300只年齡相近健康無病的巴什拜羊作為試驗羊。采用頸靜脈采血的方法，采血10 mL/只，與枸櫞酸鈉抗凝劑充分混勻置于冰盒中帶回實驗室，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要試劑和藥品

Tris平衡酚， 氯仿異戊醇， 冰無水乙醇，70%無水乙醇，2×Taq PCR MasterMix，6×Loading Buffer，D2000，ddH2O，蒸餾水，甲醛，Tris堿，EDTA-Na2，AgNO3，NaCl，SDS，NaOH，溴化乙錠，尿素，鹽酸，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，過硫酸銨，95%去離子甲酰胺，二甲苯青，溴酚藍(lán)，瓊脂糖。

1.1.3 主要試驗儀器

PH儀：瑞士梅特勒-托利多公司；電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；31BN型電泳槽：北京市六一儀器廠；HZS-H水浴振蕩器：哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠制造；HS-3垂直混合器：寧波新芝生物科技股份有限公司；TG16-W 微量高速離心機(jī)；WG700TL20Ⅱ-K6：Galanz；AL204-IC：METTLER TOLEDO；Centrifuge 5810 R：eppendorf；水平搖床：北京市六一儀器廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 巴什拜羊基因組DNA的提取

采用常規(guī)酚-氯仿抽提法提取血液基因組DNA，溶于TE中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計、合成及稀釋

1.2.2.1 引物的設(shè)計及合成 按照Genbank所公布的綿羊MC4R基因序列（JQ710684.1），運用Premier5.0軟件設(shè)計引物F:GTCGGGCGTCTTGTTCAT R:GTTTGGCACCGCAGTTTG，由上海生物工程有限公司進(jìn)行合成。

1.2.2.2 引物的稀釋 將合成的引物1 000 rpm離心1 min后，按照提供的引物稀釋說明加入ddH2O稀釋至100 μm，充分振蕩，再次1 000 rpm離心1 min，放入4℃冰箱，6 h后取出，再次加入ddH2O將貯存液稀釋至10 μm，振蕩使充分混勻，分裝到不同的eppendorf管中，置于-20℃冰箱中，用于PCR擴(kuò)增試驗。

1.2.3 PCR擴(kuò)增體系與反應(yīng)條件

PCR 擴(kuò)增反應(yīng)總體積 20 μL：DNA 模板（50 ng/ul）1 μL，上游引物（10 pmol/ul）0.5 μL，下游引物（10 pmol/ul）0.5 μL，2×Taq PCR MasterMix10 μL，再加入 8 μL 的 ddH2O 使總體積為 20 μL。

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，35個循環(huán)（94℃變性30 s，60.6℃退火30 s，72℃延伸1 min），72℃延伸5 min，4℃保存。

1.2.4 PCR-SSCP檢測

SSCP的檢測分析方法參考周延清[7]等的方法進(jìn)行。取10 μL PCR產(chǎn)物和7 μL變性劑98℃變性10 min，冰浴30 min，用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠。電泳300 V 50 mA空跑30 min，預(yù)跑10 min，180 V電泳15 h，取出用配置好的硝酸銀溶液進(jìn)行染色，30 min后取出用氫氧化鈉和甲醛溶液進(jìn)行顯色，顯色后在凝膠成像儀中進(jìn)行成像，并對結(jié)果進(jìn)行分析和判定基因型。

1.2.5 DNA測序

選取不同基因型的PCR產(chǎn)物各兩個樣品進(jìn)行測序。測序結(jié)果與Genbank中綿羊MC4R基因的核苷酸序列進(jìn)行比較，采用DNAMAN軟件和Chromas軟件對測序結(jié)果進(jìn)行綜合分析，驗證突變位點。

1.2.6 巴什拜羊體尺指標(biāo)的測定

體長、體高、體重、管圍及胸圍的測量參照《羊生產(chǎn)學(xué)》的方法[8]，對試驗羊進(jìn)行實地測量并進(jìn)行記錄。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Microsoft Excel 2003統(tǒng)計和整理巴什拜羊生產(chǎn)數(shù)據(jù)；運用軟件PIC-CALC和POPGENE32計算巴什拜羊MC4R基因的基因型頻率、等位基因頻率、純合度、雜合度、多態(tài)信息含量和有效等位基因數(shù)，并對該位點基因型的分布進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡的卡方適合性檢驗。使用SPSS 21.0軟件中的方差分析，對個體基因型與周歲巴什拜母羊的體重、體長、體高、胸圍等數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗，以“最小二乘均值士標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。顯著性檢驗，P＞0.05時差異不顯著；P＜0.05時差異顯著；P＜0.01時差異極顯著。

2 試驗結(jié)果與分析

2.1 巴什拜羊基因組DNA的檢測

用濃度為1%瓊脂糖凝膠對提取的巴什拜羊基因組DNA進(jìn)行檢測，如圖1所示，凝膠上的基因組DNA條帶整齊清晰，無拖尾現(xiàn)象，且DNA OD260/OD280值在1.6～1.8，表明基因組DNA的完整性和純度比較好，可用于后續(xù)的PCR擴(kuò)增試驗。

圖1 巴什拜羊基因組DNA檢測結(jié)果

2.2 巴什拜羊MC4R基因的PCR檢測

PCR產(chǎn)物用濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠檢測結(jié)果如圖2所示 ，PCR擴(kuò)增得到的條帶清晰明亮，無其他條帶，且擴(kuò)增片段為488bp與預(yù)期結(jié)果一致，可用于后續(xù)的SSCP試驗。

圖2 MC4R基因的PCR檢測結(jié)果

2.3 MC4基因的PCR-SSCP檢測結(jié)果

MC4R基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺凝膠檢測，電泳16 h，檢測結(jié)果如圖3，結(jié)果出現(xiàn)了兩種不同類型的條帶，分別定義為GG型和GC型。

圖3 MC4R基因的PCR-SSCP檢測結(jié)果

2.4 MC4R基因的測序結(jié)果

選擇MC4R基因擴(kuò)增的不同類型PCR產(chǎn)物各2個樣品送上海生工生物有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與Genbank上發(fā)表的綿羊MC4R基因序列 （JQ710684.1）進(jìn)行多序列比較，結(jié)果顯示MC4R基因在893bp處存在G到C的突變，可以記作G893C。結(jié)果如圖4、圖5所示。通過氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，MC4R基因在G893C處的突變并未使氨基酸的編碼發(fā)生改變，此位點突變?yōu)橥x突變。

圖4 MC4R基因的測序結(jié)果

圖5 各基因型測序峰圖

2.5 基因群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

2.5.1 MC4R基因的基因頻率和基因型頻率

由表1可知，在檢測的巴什拜羊群體中，MC4R基因存在2種基因型：GG型和GC型，GG型基因頻率是0.807，GC型的基因頻率是0.193。在巴什拜羊群體中G等位基因頻率是0.903，C等位基因頻率是0.097。且在巴什拜羊群體中等位基因G為優(yōu)勢等位基因。經(jīng)卡方檢驗，MC4R基因在巴什拜羊群體中處于哈代溫伯格平衡 （P＞0.05）。

表1 MC4R基因的基因型頻率和等位基因頻率

2.5.2 MC4R基因的遺傳參數(shù)值

對巴什拜羊MC4R基因多態(tài)信息含量、基因純合度和雜合度等進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示。從表2可得出，MC4R基因在巴什拜羊群體中的基因純合度是0.825，基因雜合度是0.175，有效等位基因數(shù)是1.212，多態(tài)信息含量為0.159，為低度多態(tài)位點。

表2 MC4R基因的基因純合度、雜合度、有效等位基因和多態(tài)信息含量

2.5.3 巴什拜羊MC4R基因不同基因型與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

由表3的分析結(jié)果可知在巴什拜羊群體中，GC型個體的胸圍顯著高于GG型個體 （P＜0.05），GC型個體的體重顯著高于GG型個體（P＜0.05），GC型和GG型個體間的體長、體高和管圍等三個指標(biāo)差異不顯著（P＞0.05）。因此，初步推測MC4R基因在G893C基因座表現(xiàn)的多態(tài)有可能作為一種遺傳標(biāo)記，通過對優(yōu)勢基因型的選擇，加快對巴什拜羊育種的遺傳改良。

表3 MC4R基因不同基因型與巴什拜羊生長性狀的關(guān)系

3 討 論

3.1 MC4R基因群體遺傳特征分析

有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量、純合度、雜合度等指標(biāo)從不同角度反映了群體的遺傳變異程度。群體的雜合度一般認(rèn)為與遺傳多樣性密切相關(guān)，群體雜合度越高，群體的遺傳變異越大，遺傳多樣性就越豐富，選擇的潛力就越大。本試驗中，MC4R基因的純合度為0.825，雜合度為0.175，有效等位基因數(shù)為1.212，多態(tài)信息含量為0.159，為低度多態(tài)位點，表明在該位點的遺傳變異較小。

3.2 MC4R基因多態(tài)性與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

近年來，對MC4R基因多態(tài)性的研究報道較多，張菊[9]等在MC4R基因中發(fā)現(xiàn)四個SNP位點，通過PIRA-PCR技術(shù)檢測1232位的G→A突變，發(fā)現(xiàn)AG和AA型較GG型具有較高的背膘厚度。張高振[10]等運用PCR-SSCP技術(shù)對湖羊群體中MC4R基因的多態(tài)性進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)在1 229位點發(fā)生G→A的突變，產(chǎn)生的3種基因型，并且發(fā)現(xiàn)3種基因型之間羔羊的出生重有顯著的差異；在1 232位點發(fā)生G→A的突變與綿羊背膘厚度相關(guān)，AA型和AG型相比于GG型有較高的背膘厚度。王春玲[11]等對湖羊MC4R基因的研究發(fā)現(xiàn)在548位點的C→T的突變與2月齡體重顯著相關(guān)。

本試驗對MC4R基因多態(tài)性的遺傳變異分析，結(jié)果顯示MC4R基因在巴什拜羊群體中存在多態(tài)性，存在2種基因型：GG和GC，測序結(jié)果顯示MC4R基因在893bp處發(fā)生堿基G到C突變。通過氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，突變并未使氨基酸的編碼發(fā)生改變，此位點突變?yōu)橥x突變。與巴什拜羊生長性狀等指標(biāo)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析可知，GC型個體的胸圍顯著高于GG型個體的胸圍（P＜0.05），GC型個體的體重顯著高于GG型個體的體重（P＜0.05），GG型和GC型個體間的體長、體高和管圍等3個指標(biāo)差異不顯著（P＞0.05）。一般認(rèn)為同義突變對動物表型和基因發(fā)揮功能沒有影響，因為同義突變沒有引起編碼氨基酸改變[12]。但有些研究表明，同義突變可以通過改變mRNA穩(wěn)定性和定位、改變基因的翻譯效率、改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)等方式影響基因的表達(dá)，最終引起表型數(shù)據(jù)的差異[13-15]。周明亮[16]等研究結(jié)果顯示在IGF-I基因外顯子3的A→G突變并未引起編碼氨基酸發(fā)生改變，但該位點的多態(tài)性與綿羊出生后的斷奶體重和斷奶日增重存在相關(guān)性。宋桃偉[17]等研究發(fā)現(xiàn)，在GHSR基因G200A處突變并未引起氨基酸的改變，但該SNP位點不同基因型的個體在體高上有顯著差異（P＜0.05）。本試驗也表明MC4R基因在893bp處存在G到C的突變對巴什拜羊體重、胸圍有顯著影響。初步推測MC4R基因在G893C處表現(xiàn)的多態(tài)有可能作為一種遺傳標(biāo)記，通過對優(yōu)勢基因型的選擇，加快對巴什拜羊育種的遺傳改良。

4 結(jié) 論

本試驗通過對MC4R基因進(jìn)行PCR-SSCP分析和測序發(fā)現(xiàn)，MC4R基因在巴什拜羊群體中有多態(tài)性，存在2種基因型：GG和GC，測序結(jié)果顯示MC4R基因在893bp處發(fā)生堿基G到C突變。關(guān)聯(lián)分析表明：巴什拜羊不同基因型之間胸圍、體重指標(biāo)差異顯著。巴什拜羊MC4R基因在G893C處表現(xiàn)的多態(tài)有可能作為一種遺傳標(biāo)記。

參考文獻(xiàn)：

[1]YEO GS,FAROOQI I S,CHALLIS BG,et al.The role of melanocortin signalling in the control of body weight:Evidence from human and murine genetic models[J].Quarterly Journal of Medicine,2000,93（1）:7-14.

[2]劉嬌嬌.綿羊MC4R、MRF4、PROP1基因多態(tài)性及生物信息學(xué)分析[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

[3]左北瑤,錢宏光.MC4R基因研究進(jìn)展[J].中國草食動物,2011,31（5）:45-50.

[4]國家畜禽遺傳資源委員會組編.中國畜禽遺傳資源志·羊志[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，2011，122-123.

[5]買買提明·巴拉提,哈米提·哈凱莫夫,決肯·阿努瓦什.羔羊肉型巴什拜羊的研究[J].草食家畜,1999，（02）:16-19.

[6]努爾拉提汗·木哈買提別克,賽力克·木勒達(dá)汗,決肯·阿尼瓦什,等.新疆巴什拜羊青色和白色毛絨品質(zhì)比較分析[J].新疆畜牧業(yè),2015，（11）:25-27.

[7]周延清,楊清香,張改娜.生物遺傳標(biāo)記與應(yīng)用[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2008，104-105.

[8]張英杰.羊生產(chǎn)學(xué)[M].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2010，252-253.

[9]張菊.綿羊CAST、MC4R和BTG1基因的克隆、組織表達(dá)和遺傳多態(tài)性分析[D].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2009.

[10]張高振.MC4R基因多態(tài)性及其與湖羊早期生長性狀的相關(guān)研究[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2009,06.

[11]王春玲,茆達(dá)干,曹少先,等.6個綿羊群體MC4R基因CRS-PCR多態(tài)性及其與湖羊、東湖雜交羊生長性狀的關(guān)聯(lián)分析[J].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,37（l）:121-126.

[12]Komar A A.Silent SNPs:impact on gene function and phenotype[J].Pharmacogenomics,2007,8（8）:1075-1080.

[13]任法鑫,楊鈞國,李偉,等.國人SCN5A基因新的同義突變位點[J].中國循環(huán)雜志,2004，（05）:52-54.

[14]陳南春,高輝,陳蘇民,等.cⅠ857基因的體外定位同義突變[J].生物化學(xué)雜志,1994，（04）:509-512.

[15]L.Corrado,S.Magri,A.Bagarotti,et al.A novel synonymous mutation in the MPZ gene causing an aberrant splicing pattern and Charcot-Marie-Tooth disease type 1b[J].Neuromuscular Disorders,2016.

[16]周明亮,張翔宇,綦松智,等.綿羊IGF-Ⅰ基因的表達(dá)及其SNPs與生長性狀的相關(guān)分析研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2013,44（09）:1363-1370.

[17]宋桃偉,蔡慧芬,羅衛(wèi)星,等.兩個貴州山羊品種GHSR和GHRL基因遺傳變異及其與生長性狀的關(guān)聯(lián)性[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,48（l）:140-153.