冀萌萌，譚雪梅，余凱倫，張秀麗，王宗立，陶宇昌，劉蔓蔓，高 湛，劉小轉(zhuǎn)，余增麗

1)鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室 鄭州 450001 2)鄭州市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 鄭州 450006 3)鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州 450052 4)河南省人民醫(yī)院科研與學(xué)科建設(shè)部 鄭州 450003

目前，由于社會(huì)環(huán)境、生活壓力以及“二胎”生育政策放開的影響，我國女性的生育年齡越來越晚[1]。但隨著年齡的增長，女性的生育能力逐漸下降。因此探索卵巢衰老的病理生理過程和發(fā)生機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上找出延緩卵巢衰老的干預(yù)靶點(diǎn)，有重要意義。卵巢衰老主要表現(xiàn)為卵泡數(shù)量和質(zhì)量的下降，年齡是最重要的影響因素[2-3]。人類原始卵泡池形成于胎兒期，在孕期20周時(shí)達(dá)到高峰，然后急劇減少，近青春期時(shí)，卵巢內(nèi)原始卵泡僅剩40萬個(gè)[4-5]。女性在50歲閉經(jīng)時(shí)，卵巢中僅剩下大約1 000個(gè)原始卵泡[4,6]。目前，控制原始卵泡存活和喪失平衡的分子機(jī)制還不太明確。研究[7-10]表明，在卵泡發(fā)育過程中，大量mRNA和蛋白儲(chǔ)存于卵母細(xì)胞內(nèi)并被其利用，而卵母細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)主宰著其對發(fā)育能力的最終獲得。有研究[11-12]表明，年輕與老年女性之間決定卵母細(xì)胞生物功能的關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄水平存在差異，有可能與卵巢老化有關(guān)。

本研究通過分析基因表達(dá)譜芯片數(shù)據(jù)集GSE44533，鑒別不同年齡段的恒河猴卵巢樣本中差異表達(dá)基因(differentially expressed genes, DEGs)，然后對DEGs進(jìn)行GO富集、KEGG通路分析及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction, PPI)分析，探索卵巢組織中潛在的受年齡影響的生物標(biāo)志物和信號通路。

1 材料與方法

1.1材料GSE44533數(shù)據(jù)集來源于美國國家生物信息中心的GSE數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)集包含了由GPL3535芯片平臺(tái)采集的9個(gè)恒河猴卵巢樣品的基因芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)，分為老、中、青3個(gè)年齡組，每組3個(gè)樣品。其中，老年組恒河猴年齡18～19歲，已經(jīng)喪失生育能力；中年組年齡7～8歲，為最佳生育期；青年組年齡3～4歲，具有正常規(guī)律的動(dòng)情周期；均未繁殖過。按照中、青年恒河猴的動(dòng)情周期記錄，均于動(dòng)情前期處死并采集卵巢。

1.2數(shù)據(jù)處理及DEGs的篩選首先，利用SAS 9.2 及RNA Express軟件對GSE44533數(shù)據(jù)集進(jìn)行預(yù)處理、背景矯正、數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化等。將探針與從Affymetrix官方網(wǎng)站(http://www.affymetrix.com)下載的注釋文件進(jìn)行匹配，得到包含官方基因符號的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)集；在Morpheus網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)(https://sofeware.brodinstitute.org/morpheus/)，根據(jù)信噪比≥4或者≤-4，篩選出DEGs。

1.3DEGs的功能富集分析采用DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)在線對篩選出的DEGs進(jìn)行功能富集分析，預(yù)設(shè)條件為ease score≤0.1 和 thresholds account≥2。功能富集分析主要包括GO功能分析和KEGG通路富集分析。

1.4DEGs的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析STRING(http://string-db.org/)是用于檢索分子交互作用的搜索工具，旨在評估蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的關(guān)系。新版本STRING10.5涵蓋了來自于2 031個(gè)生物體的960萬個(gè)蛋白質(zhì)。本研究中，設(shè)置組合分?jǐn)?shù)(combined score)>0.4過濾PPI數(shù)據(jù)，利用STRING檢索DEGs中的交互基因，然后應(yīng)用Cytoscape 3.5.1軟件中的MCODE，按照預(yù)設(shè)條件(理發(fā)模式，節(jié)點(diǎn)評分截止值為0.2，K核心值為2)進(jìn)行重塑，構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)模塊。

2 結(jié)果

2.1DEGs的篩選青年組與中年組卵巢基因表達(dá)譜比較，共有253個(gè)DEGs，其中123個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，130個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；中年組與老年組比較，共有68個(gè)DEGs，其中50個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，18個(gè)基因表達(dá)下調(diào)；青年組與老年組比較，共有636個(gè)DEGs，其中460個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，176個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。

2.2DEGs的功能富集青年組與中年組、中年組與老年組、青年組與老年組DEGs的GO分析結(jié)果見表1～3，表內(nèi)Count(%)為對應(yīng)GO的DEGs數(shù)目(對應(yīng)GO的DEGs數(shù)目/能夠?qū)?yīng)到GO數(shù)據(jù)庫中同類型的DEGs數(shù)目×100%)；KEGG通路富集結(jié)果見表4，其中Count(%)為對應(yīng)pathway富集基因數(shù)目(對應(yīng)pathway富集基因數(shù)目/能夠?qū)?yīng)到pathway數(shù)據(jù)庫中的DEGs數(shù)目×100%)。GO功能分析時(shí)，從細(xì)胞組分、分子功能和生物過程3個(gè)方面展開。結(jié)果表明，3組DEGs在全細(xì)胞和細(xì)胞外區(qū)域廣泛分布，涉及氧化應(yīng)激、DNA復(fù)制、修復(fù)和甲基化等方面。青年組與老年組的DEGs參與的生物過程主要有DNA結(jié)構(gòu)與轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA甲基化過程等；中年組與老年組的DEGs涉及的信號通路有卵母細(xì)胞減數(shù)分裂，涉及的基因?yàn)镕BXO43、AURKA、PPP2R5E；而青年組與老年組的DEGs涉及丙酮酸代謝通路等。

表1 青年組與中年組的DEGs的GO分析

表2 中年組與老年組的DEGs的GO分析

表3 青年組與老年組的DEGs的GO分析

續(xù)表3

表4 3組DEGs的KEGG分析

2.3DEGs的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)PPI分析結(jié)果顯示，僅青年組與老年組DEGs的模塊M1(score=6，node=6，edges=15)和M2(score=4，node=4，edges=6)符合條件,其中，M1包含6個(gè)基因(SNRNP200、DDX46、SNRNP35、DAZ2、ELAVL2、RBM46，見圖1、2)，M2包含4個(gè)基因(AURKa、EHMT2、AURKC、LOC715011)。

圖1 青年組與老年組DEGs的PPI

圖2 M1模塊

3 討論

隨著年齡增長，卵巢逐漸老化，而卵巢衰老主要表現(xiàn)為卵泡數(shù)量和質(zhì)量的逐漸下降，導(dǎo)致女性生育能力下降甚至不育。而原始卵泡被招募到生長卵泡池中進(jìn)行后續(xù)的發(fā)育[4,13]，卵母細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的原始卵泡丟失等[14]，均決定了卵巢老化的進(jìn)程[4-5,15]。在這些過程中，不同年齡階段的卵巢組織中基因表達(dá)譜可能存在差異，影響卵巢卵泡的數(shù)量及質(zhì)量。本研究證實(shí)，青年組、中年組、老年組恒河猴卵巢組織中的基因表達(dá)譜存在差異。其中青年組與中年組之間有253個(gè)DEGs，中年組與老年組之間有68個(gè)DEGs，而青年組與老年組之間有636個(gè)DEGs。根據(jù)GO功能分析及KEGG通路富集分析結(jié)果，這些DEGs部分涉及卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、丙酮酸代謝通路等。

在青年組與老年組DEGs的PPI分析中，模塊M1包含6個(gè)基因,分別為SNRNP200、DDX46、SNRNP35、DAZ2、ELAVL2、RBM46，這6個(gè)基因存在細(xì)胞分子交互作用。其中ELAVL2最初被描述為神經(jīng)元蛋白，但是有研究[16]表明在保守表達(dá)的卵母細(xì)胞中ELAVL2轉(zhuǎn)錄水平比體細(xì)胞更豐富，其與卵母細(xì)胞的發(fā)育到底有何聯(lián)系，值得探索。RBM46(RNA結(jié)合基序蛋白46)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控β-連環(huán)蛋白mRNA的降解，通過Wnt/β-聯(lián)蛋白途徑在胚胎干細(xì)胞分化調(diào)節(jié)中起重要作用[17]。DAZ2是精子發(fā)生相關(guān)蛋白，其在卵巢組織中出現(xiàn)異常表達(dá)，提示其可能對卵泡發(fā)育有關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用，并且該調(diào)節(jié)與排卵后的精卵結(jié)合有關(guān)，當(dāng)然，其在雌性生殖發(fā)育中的作用有待進(jìn)一步研究。DDX46屬于RNA解旋酶的DEAD盒系列，其涉及二級RNA結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)[18]，在復(fù)雜的器官發(fā)育中起重要作用。SNRNP35和SNRNP200均屬于剪接因子。目前關(guān)于SNRNP200的研究較多關(guān)注的是其基因拷貝數(shù)突變與視網(wǎng)膜色素變性的關(guān)系[19-20]；關(guān)于SNRNP35的研究很少見，其可能是新發(fā)現(xiàn)的與卵巢發(fā)育有關(guān)的基因。

本研究雖然找出了不同年齡段恒河猴卵巢組織中部分基因表達(dá)的變化規(guī)律，但目前進(jìn)行的數(shù)據(jù)分析工作還比較初步，今后還需要對篩選出來的關(guān)鍵基因進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以探索其在卵巢卵泡發(fā)育過程中的作用，闡明卵巢衰老的病理生理過程和發(fā)生機(jī)制。

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