許 堯 張利龍 胡雨奇 龍尚琴

孫露丹 王靖宇 李 明 董建一

導(dǎo)盲犬是輔助視障人士出行的工作犬。目前，我國(guó)的導(dǎo)盲犬培訓(xùn)成功率低、成本高、周期長(zhǎng)，因此，如何更有效地輔助導(dǎo)盲犬篩選及培訓(xùn)是科研工作者一直在探索的問(wèn)題。導(dǎo)盲犬培訓(xùn)成功與否主要是通過(guò)動(dòng)物行為學(xué)對(duì)犬的興奮性、焦慮、應(yīng)激反應(yīng)和認(rèn)知功能等行為和情緒進(jìn)行評(píng)判。近年來(lái)的研究顯示，腸道菌群是人體重要的“微生態(tài)器官”，可通過(guò)神經(jīng)遞質(zhì)途徑影響哺乳動(dòng)物的行為和情緒，但目前這方面的研究較少。導(dǎo)盲犬腸道菌群的分析研究及干預(yù)手段可能有助于輔助導(dǎo)盲犬的篩選和培訓(xùn)。

導(dǎo)盲犬是一種為視障人士提供幫助的工作犬。目前主要通過(guò)動(dòng)物行為學(xué)測(cè)試對(duì)犬的神經(jīng)類(lèi)型（如應(yīng)激反應(yīng)、焦慮、抑郁和認(rèn)知功能等行為和情緒）進(jìn)行評(píng)判達(dá)到篩選的目的，但其具有較強(qiáng)的主觀性。腸道菌群參與了人類(lèi)及哺乳動(dòng)物體內(nèi)多種生理過(guò)程，越來(lái)越多的研究證明，人體內(nèi)存在的腦-腸軸（brain-gut axis）可能是大腦與胃腸道之間的關(guān)鍵調(diào)控通路，大腦可能通過(guò)免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等多種途徑調(diào)控胃腸功能，而腸道菌群則可能通過(guò)迷走神經(jīng)、神經(jīng)遞質(zhì)（如5-羥色胺、多巴胺）、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（如腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子）等途徑影響大腦功能。有研究表明，腸道菌群可能影響人類(lèi)及哺乳動(dòng)物的大腦發(fā)育，腸道菌群失調(diào)可產(chǎn)生情感障礙、自閉癥譜系障礙等疾病。因此對(duì)于導(dǎo)盲犬腸道菌群的研究及干預(yù)可能有助于提高導(dǎo)盲犬培訓(xùn)成功率。

一、導(dǎo)盲犬的應(yīng)用情況和研究進(jìn)展

目前，導(dǎo)盲犬培訓(xùn)成功率低（30%～40%）、培訓(xùn)成本高（約15萬(wàn)元/頭）、培訓(xùn)周期長(zhǎng)（約18個(gè)月）等問(wèn)題導(dǎo)致每年培訓(xùn)合格的導(dǎo)盲犬?dāng)?shù)量稀少，難以滿(mǎn)足我國(guó)1691萬(wàn)視障人士的需求。導(dǎo)盲犬的篩選與培訓(xùn)可能受到多種因素的影響，其中，犬的神經(jīng)類(lèi)型是影響導(dǎo)盲犬篩選的關(guān)鍵因素。同一犬種一般分為4種神經(jīng)類(lèi)型，即興奮型、活潑型、安靜型、弱型。合格的工作犬必須具備平和的心態(tài)、穩(wěn)定的性情以及抗外界干擾能力，同時(shí)也不具有攻擊性，因此安靜型犬是導(dǎo)盲犬篩選和培訓(xùn)工作中的重要考察指標(biāo)。Harvey N D等的數(shù)據(jù)調(diào)查和其他研究成果表明犬神經(jīng)類(lèi)型篩選工作中的重要參考指標(biāo)應(yīng)包括犬注意力分散性（distractibility）、興奮性（excitability）、一般焦慮（general anxiety）、敏感性（sensitivity）等方面特征。

動(dòng)物行為學(xué)測(cè)試是指在標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)條件下，利用特定刺激來(lái)引起動(dòng)物的行為反應(yīng)，通過(guò)對(duì)行為反應(yīng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)、分析、對(duì)比，評(píng)估動(dòng)物的主要行為類(lèi)型或特征。犬的動(dòng)物行為學(xué)測(cè)試是導(dǎo)盲犬行為學(xué)研究中的重要工具，有利于神經(jīng)類(lèi)型的早期分析和篩選。廣泛的實(shí)踐證明，由于缺乏統(tǒng)一的測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)和方法，動(dòng)物行為學(xué)測(cè)試仍存在一定的主觀性、局限性和未知性，其不僅受到犬的品種、性別、年齡、生理狀況等諸多內(nèi)在因素的作用，還會(huì)受到犬所處的生活環(huán)境、訓(xùn)練人員的經(jīng)驗(yàn)、培訓(xùn)方法等外在因素的影響。因此，尋找客觀有效的導(dǎo)盲犬篩選方法是世界各國(guó)導(dǎo)盲犬機(jī)構(gòu)一直在探索的問(wèn)題。

二、腸道菌群對(duì)哺乳動(dòng)物行為和情緒的影響

腸道菌群與哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能密切相關(guān)，可直接調(diào)控其行為和情緒。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Brain-Derived Neurotropic Factor，BDNF）是一種能刺激神經(jīng)發(fā)生、調(diào)節(jié)突觸形成的可塑性蛋白質(zhì)，還可參與機(jī)體認(rèn)知、行為和情緒等多方面的活動(dòng)，在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，無(wú)菌小鼠大腦皮層和海馬中BDNF表達(dá)量明顯降低；而B(niǎo)ercik P等在研究中給腸道慢性炎癥小鼠喂食雙歧桿菌后，其BDNF的mRNA水平可恢復(fù)正常。利用TNBS（2,4,6-三硝基苯磺酸）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠腸道菌群組的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠大腸桿菌（Escherichia coli，EC）豐度增加和約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii，LJ）豐度減少，并伴有明顯的記憶障礙。同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)EC可損害小鼠的學(xué)習(xí)能力并導(dǎo)致記憶障礙，而LJ可減輕TNBS或EC處理小鼠的結(jié)腸炎和記憶障礙癥狀，表明腸道菌群可對(duì)哺乳動(dòng)物的學(xué)習(xí)和記憶能力產(chǎn)生重要影響。Stilling等發(fā)現(xiàn)與正常小鼠相比，無(wú)菌小鼠許多重要腦生理過(guò)程如神經(jīng)傳遞、神經(jīng)元可塑性、代謝和形態(tài)發(fā)育的基因表達(dá)具有顯著差異，而這些基因的表達(dá)與認(rèn)知、情緒和社會(huì)行為密切相關(guān)。

另外，腸道菌群與哺乳動(dòng)物精神、神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙關(guān)系密切，Kelly等的研究結(jié)果表明抑郁癥小鼠腸道菌群在組成或多樣性方面發(fā)生了明顯變化；研究顯示小鼠在幼年時(shí)期受到母子分離刺激，成年后其表現(xiàn)出的過(guò)度應(yīng)激行為可能與其腸道菌群的長(zhǎng)期改變有關(guān)；Crumeyrolle-Arias等研究發(fā)現(xiàn)在開(kāi)放區(qū)域測(cè)試中，無(wú)菌大鼠相比于SPF（Specific pathogen Free）大鼠具有更多焦慮行為，包括潛伏時(shí)間延長(zhǎng)、在中央?yún)^(qū)域活動(dòng)的次數(shù)減少及在周邊區(qū)域活動(dòng)的時(shí)間增加等。研究表明服用益生菌可明顯改善小鼠由慢性應(yīng)激刺激引起的焦慮行為，具有積極而明確的治療作用。

三、腸道菌群調(diào)節(jié)宿主行為和情緒的作用途徑

腦-腸軸通路 腦-腸軸是大腦和胃腸道之間緊密連接的雙向通路，在調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)功能、機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)及認(rèn)知等方面起到了重要作用?，F(xiàn)有的大量研究證明了腸道菌群可通過(guò)腦-腸軸如神經(jīng)遞質(zhì)途徑、免疫途徑、短鏈脂肪酸代謝途徑、microRNA代謝途徑等調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物的行為和情緒，其中神經(jīng)遞質(zhì)途徑是研究的焦點(diǎn)。

5-羥色胺通路 5-羥色胺（5-HT）又稱(chēng)血清素，是一種在哺乳動(dòng)物中廣泛存在的神經(jīng)遞質(zhì)，可調(diào)節(jié)宿主認(rèn)知、情緒等生理活動(dòng)。已有研究證明梭菌（Clostridiales）可以調(diào)節(jié)胃腸道中的5-HT代謝，最新的研究發(fā)現(xiàn)自閉癥譜系障礙（Autism Spectrum Disorder，ASD）小鼠腸道5-HT水平與Blautia菌屬的相對(duì)豐度呈明顯正相關(guān)，研究者認(rèn)為Blautia菌屬豐度的降低可能是ASD小鼠腸道中5-HT合成減少的主要原因。因此，5-HT通路可能是腸道菌群調(diào)節(jié)宿主行為和情緒的重要途徑之一。

多巴胺通路 多巴胺是一種可由腸道菌群調(diào)控的神經(jīng)遞質(zhì)。經(jīng)卒中抑郁患者糞菌移植的大鼠普雷沃菌屬（Prevotella）、顫克桿菌屬（Humicola）豐度相比于正常大鼠明顯降低，單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)測(cè)定結(jié)果顯示經(jīng)糞菌移植的大鼠多巴胺、5-HT含量相比于正常大鼠也明顯降低，表明單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)可能參與大鼠卒中抑郁的發(fā)生發(fā)展。另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，三生合歡飲具有良好的抗抑郁作用，并能調(diào)節(jié)抑郁模型小鼠腸道菌群，其多巴胺含量也相應(yīng)提高，提示腸道菌群可能通過(guò)多巴胺通路調(diào)節(jié)宿主的行為。

γ-氨基丁酸通路 γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。已有研究發(fā)現(xiàn)，口服GABA具有緩解焦慮、改善睡眠質(zhì)量、減少應(yīng)激等積極作用，由此可見(jiàn)，GABA對(duì)腦功能和神經(jīng)活動(dòng)具有重要的調(diào)節(jié)作用。已知乳酸桿菌、雙歧桿菌都能夠參與內(nèi)源性GABA的合成，腸道菌群可能通過(guò)調(diào)節(jié)GABA的產(chǎn)生直接作用于腦-腸軸。

四、腸道菌群分析用于導(dǎo)盲犬研究的潛在可能性

腸道菌群研究深入各個(gè)領(lǐng)域。事實(shí)上，當(dāng)前對(duì)哺乳動(dòng)物腸道菌群的研究主要基于無(wú)菌大鼠和小鼠模型的實(shí)驗(yàn)，另有學(xué)者在豬、犬等其他動(dòng)物的腸道菌群研究領(lǐng)域也取得了一定的成果，較為準(zhǔn)確地揭示了腸道菌群通過(guò)復(fù)雜的神經(jīng)遞質(zhì)途徑對(duì)哺乳動(dòng)物的行為和情緒等方面的積極影響。然而，關(guān)于導(dǎo)盲犬的腸道菌群研究目前在國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。犬的行為和情緒與其神經(jīng)類(lèi)型密切相關(guān)，腸道菌群可能通過(guò)神經(jīng)遞質(zhì)途徑對(duì)犬神經(jīng)類(lèi)型產(chǎn)生影響。因此，我們能夠以篩選導(dǎo)盲犬的關(guān)鍵因素（神經(jīng)類(lèi)型）為切入點(diǎn)，初探腸道菌群對(duì)導(dǎo)盲犬篩選及培訓(xùn)的影響。

犬腸道菌群分析。一方面，通過(guò)DGGE、高通量測(cè)序等實(shí)驗(yàn)分析導(dǎo)盲犬與淘汰犬的腸道菌群，尋找出兩組差異明顯的特定菌種，可能作為神經(jīng)類(lèi)型篩選的微生物學(xué)指標(biāo)；另一方面，通過(guò)生化檢測(cè)實(shí)驗(yàn)分析兩組5-HT、多巴胺、GABA等神經(jīng)遞質(zhì)，若其差異與菌種差異明顯相一致，則能在很大程度上證明腸道菌群對(duì)培訓(xùn)成功率的影響，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可深入探究其具體機(jī)制和作用途徑。

通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群改善犬的神經(jīng)類(lèi)型。目前學(xué)界普遍認(rèn)為膳食中合理補(bǔ)充益生菌和益生元是最廣泛地用以輔助調(diào)節(jié)腸道微生物群的方式，益生菌治療在改善哺乳動(dòng)物焦慮、抑郁等異常行為和情緒方面具有顯而易見(jiàn)的積極作用，因此益生菌治療用于幼犬可能改善其腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成，調(diào)節(jié)腸道菌群失衡引起的各類(lèi)胃腸道疾病與神經(jīng)系統(tǒng)功能異常，最終使幼犬的神經(jīng)類(lèi)型向著有利于導(dǎo)盲犬培訓(xùn)的預(yù)期方向發(fā)展，從而有助于提高培訓(xùn)成功率。值得注意的是，有研究人員發(fā)現(xiàn)，無(wú)菌小鼠在生命早期接觸腸道菌群后將與正常小鼠具有相似的行為及基因表達(dá)，而當(dāng)無(wú)菌小鼠成年后再重建腸道菌群則無(wú)法改變其行為，這意味著利用調(diào)節(jié)腸道菌群的方法治療小鼠功能障礙可能存在一段最適時(shí)間段，此結(jié)論在導(dǎo)盲犬中可能同樣適用。

五、總結(jié)與展望

我國(guó)的導(dǎo)盲犬事業(yè)經(jīng)歷十余年的發(fā)展，現(xiàn)已取得了驕人的成果。但不可否認(rèn)的是，相比于實(shí)際需要的巨大缺口，如何解決我國(guó)當(dāng)前導(dǎo)盲犬培訓(xùn)成功率低的問(wèn)題顯得至關(guān)重要。雖然目前尚未有研究報(bào)道直接證明腸道菌群對(duì)導(dǎo)盲犬培訓(xùn)成功率的影響，但是基于目前的哺乳動(dòng)物模型研究和臨床研究結(jié)果，其結(jié)論的正確性具備有力的理論依據(jù)的支持。將腸道菌群或神經(jīng)遞質(zhì)產(chǎn)物作為預(yù)測(cè)導(dǎo)盲犬培訓(xùn)成功率的雙重指標(biāo)，不僅操作簡(jiǎn)單易行，還可大大減少培訓(xùn)成本，提早淘汰有不可矯正性格和行為的犬；與此同時(shí)，利用益生菌治療有利于維持幼犬腸道微生態(tài)平衡，改善其抑郁、焦慮、狂躁、過(guò)度興奮等異常行為和情緒，進(jìn)而有助于提高導(dǎo)盲犬的培訓(xùn)成功率，為我國(guó)廣大的視障人士帶去福音。目前本課題組正在開(kāi)展這方面的研究。隨著研究的不斷深入，我們堅(jiān)信未來(lái)可以尋找到更多科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)、實(shí)際可行的方法來(lái)幫助導(dǎo)盲犬事業(yè)的發(fā)展與進(jìn)步。