張達容，王維蓮，吳立翔，柳滿然

(1.重慶大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院 重慶市腫瘤研究所 重慶市腫瘤醫(yī)院 檢驗科，重慶 400030；2.武警重慶市總隊醫(yī)院檢驗科，重慶 400061； 3.重慶醫(yī)科大學(xué) 檢驗醫(yī)學(xué)院 臨床檢驗診斷學(xué)教育部重點實驗室， 重慶 400016)

乳腺癌是女性中最多見的惡性腫瘤。根據(jù)2017年最新的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，乳腺癌在美國女性全部新發(fā)癌癥所占比例為30%，而因乳腺癌死亡患者占全部因癌死亡患者的14%，為第二死亡病因，僅次于肺癌[1]。其中乳腺癌患者治療后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是其死亡的主要原因[2]。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的本質(zhì)特征，也是腫瘤治療學(xué)所面臨的最具挑戰(zhàn)的問題，因此，進一步闡明腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制是制定新的治療方案的理論基礎(chǔ)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Twist基因可誘導(dǎo)細胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial to mesenchymal transition, EMT),促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[3- 4]，但其在乳腺癌中的具體作用尚有待進一步研究。本研究首先通過慢病毒技術(shù)，靶向沉默人三陰性乳腺癌細胞Hs578TTwist基因的表達，然后進一步研究Twist基因沉默對人三陰性乳腺癌細胞Hs578T遷移和侵襲能力的影響，并初步探討其潛在的機制，這為深入研究Twist基因在三陰性乳腺癌細胞中的具體作用提供了一定基礎(chǔ)和思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人三陰性乳腺癌細胞Hs578T(由本實驗室保存)。RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco公司)；Trizol和PCR引物(Invitrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑(TaKaRa公司)； RIPA蛋白裂解液和BCA蛋白定量檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；鼠抗人Twist蛋白單克隆抗體(Abcam公司)；兔抗人p-AKT、AKT、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司)；鼠抗人β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的山羊抗小鼠/兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；ECL化學(xué)發(fā)光試劑(Bio-Rad公司)；基質(zhì)膠(BD Biosciences公司)；Tanswell小室(Millipore公司)；包含Twist基因特異性干擾序列(5′-AAGCTGAGC AAGATTCAGACC-3′)和陰性對照序列的慢病毒載體(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 貼壁培養(yǎng)細胞：將人三陰性乳腺癌細胞Hs578T用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，所有細胞均置于37 ℃、5% CO2無菌恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2.2 慢病毒載體包裝及細胞轉(zhuǎn)染：參照本實驗室方法[5]，轉(zhuǎn)染構(gòu)建人三陰性乳腺癌細胞Hs578TTwist基因靶向沉默細胞系(shTwist)、陰性對照細胞系(shNC)和空白對照組(blank)，并利用倒置熒光顯微鏡觀察細胞轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 RT-qPCR檢測各組細胞TwistmRNA表達水平：待細胞增殖至80%匯合度時，采用Trizol試劑提取shTwist組細胞、shNC組細胞和blank組細胞的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄cDNA。采用SYBR Green法進行RT-qPCR檢測，Twist基因引物序列為：上游5′-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG-3′，下游5′-TCTGGAGGACCTGGTAGAGG-3′。反應(yīng)體系：95 ℃預(yù)變性30 s, 95 ℃變性10 s, 55 ℃退火30 s, 72 ℃延伸20 s，40個循環(huán)。

1.2.4 Western blot檢測各組細胞Twist蛋白及AKT/ERK信號通路蛋白表達水平：待細胞增殖至80%匯合度時，收集shTwist組細胞、shNC組細胞和blank組細胞，利用RIPA蛋白裂解液裂解各組細胞，通過BCA蛋白定量檢測試劑盒測定各組細胞蛋白濃度，經(jīng)12% SDS-PAGE膠分離蛋白，一抗(Twist、p-AKT、AKT、p-ERK1/2、ERK1/2和β-actin)1∶1 000稀釋置于4 ℃冰箱孵育過夜，然后將HRP標記二抗(山羊抗兔，山羊抗鼠)1∶1 000稀釋置于室溫孵育1 h，ECL試劑發(fā)光顯色，凝膠成像分析儀采集圖像。

1.2.5 Transwell實驗檢測各組細胞遷移和侵襲能力：沿用本實驗室操作方法[6]，其中加入各組細胞量為3×104個細胞，培養(yǎng)時間為8 h。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建Twist穩(wěn)定沉默細胞系

shTwist組細胞和shNC組細胞熒光比例均達到95%以上，而對照組(blank)無熒光表達(圖1)。

與陰性對照組(shNC)和對照組(blank)細胞相比，shTwist組細胞TwistmRNA(P<0.05)(圖2A)和蛋白(P<0.05)(圖2B)表達水平顯著降低。

2.2 Twist基因沉默抑制人三陰性乳腺癌細胞Hs578T遷移和侵襲能力

與陰性對照組(shNC)和對照組(blank)細胞相比，shTwist組細胞的遷移和侵襲細胞數(shù)明顯增高(P<0.05，P<0.05)(圖3)。

2.3 Twist基因沉默下調(diào)AKT/ERK信號通路蛋白表達

與陰性對照組(shNC)和對照組(blank)細胞相比，shTwist組細胞的p-AKT和p-ERK1/2蛋白表達顯著下降(P<0.05，P<0.05)(圖4)。

圖1 倒置熒光顯微鏡觀察各組細胞熒光表達Fig 1 Expression of fluorescence protein in different groups (scale bars=200 μm)

A.Twist mRNA expression levels; B&C.Twist protein expression levels; *P<0.05 compared with blank and shNC group圖2 RT-qPCR和Western blot檢測Twist mRNA和蛋白水平的表達Fig 2 Expression of Twist mRNA and protein in different n=3)

*P<0.05 compared with blank and shNC group圖3 Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力Fig 3 Abilities of cell migration and invasion in different groups (scale bars=200 μm)

*P<0.05 compared with blank and shNC group圖4 Western blot檢測AKT/ERK信號通路蛋白的表達Fig 4 Expression of AKT/ERK signaling pathway proteins in different n=3)

3 討論

全球乳腺癌發(fā)病率一直處于上升趨勢，在中國乳腺癌發(fā)病率位居女性惡性腫瘤第一位[7]。由于三陰性乳腺癌患者迄今未見確切有效的臨床靶向藥物，且具有更高的5年內(nèi)復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移風(fēng)險[8]，因此，三陰性乳腺癌的防治研究成了近期乳腺腫瘤研究中的熱點及難點，探討其侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制對其防治具有重要意義。

本研究選取具有高遷移和侵襲能力的三陰性乳腺癌細胞Hs578T作為研究對象，通過慢病毒技術(shù)攜帶特異性Twist干擾RNA，靶向沉默Twist基因的表達，通過檢測細胞熒光表達情況以及TwistmRNA和蛋白表達水平，證實成功構(gòu)建Twist基因穩(wěn)定沉默的Hs578T細胞系。然后通過Transwell遷移和侵襲實驗，檢測Twist基因穩(wěn)定沉默后細胞遷移和侵襲能力變化，發(fā)現(xiàn)Twist基因沉默可以顯著降低細胞遷移和侵襲能力。為了進一步研究其潛在的分子機制，本研究檢測了AKT和ERK信號通路的變化，結(jié)果表明Twist基因穩(wěn)定沉默后p-ERK1/2和p-AKT表達水平明顯降低，說明AKT和ERK信號通路可能參與Twist介導(dǎo)的三陰性乳腺癌細胞遷移和侵襲過程。但是否還有其他信號通路參與其中，以及Twist具體作用機制還有待進一步研究。

綜上所述，本研究通過shRNA介導(dǎo)的慢病毒技術(shù)成功建立Twist基因穩(wěn)定沉默細胞系，證實Twist基因沉默可以明顯抑制三陰性乳腺癌細胞Hs578T的遷移和侵襲能力，初步證實Twist可能通過AKT和ERK信號通路調(diào)控三陰性乳腺癌細胞Hs578T的遷移和侵襲。本研究構(gòu)建了良好的細胞模型，為進一步深入研究Twist促腫瘤的具體作用機制奠定了一定的實驗基礎(chǔ)。

：

[1] Siegel RL, Miller KD, Jemal A. Cancer Statistics, 2017 [J]. CA Cancer J Clin, 2017, 67: 7- 30.

[2] Goldhirsch A, Winer EP, Coates AS,etal. Personalizing the treatment of women with early breast cancer: highlights of the St Gallen International Expert Consensus on the Primary Therapy of Early Breast Cancer 2013 [J]. Ann Oncol, 2013, 24: 2206- 2223.

[3] Sanz-Moreno V. Tumour invasion: a new twist on Rac-driven mesenchymal migration [J]. Curr Biol, 2012, 22: 449- 451.

[4] Wang D, Li Q, Li K,etal. Twist-related protein 1-med-iated regulation of mesenchymal change contributes to the migration and invasion of cervical cancer cells [J]. Oncol Lett, 2015, 10: 3107- 3112.

[5] 文思陽,徐麗云,杜燕娥,等.穩(wěn)定干擾ITGB3基因可促進人乳腺癌BT549細胞的增殖[J].腫瘤,2016,36:538- 544.

[6] 郎磊,周明莉,楊佳佳,等.高表達ITGB1促進人乳腺上皮MCF10A細胞EMT及遷移[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2016,36:1511- 1516.

[7] Chen W, Zheng R, Baade PD,etal. Cancer statistics in China, 2015 [J]. CA Cancer J Clin, 2016, 66: 115- 132.

[8] 李愛玲,崔全才,李宏偉,等.曲妥珠單抗降低乳腺癌細胞條件培養(yǎng)液促血管內(nèi)皮細胞增殖[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2008,28:436- 440.