胡瓊方，董建生，高文庚

（1.山西農業(yè)大學食品科學與工程學院，山西太谷030801；2.山西瑞芝生物科技有限公司，山西運城 044000；3.運城學院生命科學系，山西運城044000）

靈芝（Ganoderma lucidum）別名赤芝、丹芝，靈芝屬真菌，其作為藥用已有兩千多年歷史，在《本草綱目》和《神農本草經(jīng)》中均有記載?，F(xiàn)代研究證實，靈芝中含有多種活性成分，包括多糖類、三萜類、核苷類、甾醇類、氨基酸蛋白類等，其中多糖和三萜類是靈芝藥效的主要物質基礎[1]。

靈芝三萜類化合物具有抑菌、抗腫瘤、保肝、抗氧化、抗HIV和抑制HIV-1蛋白酶活性、抗炎癥的作用[2-11]，其提取方法多種，包括回流浸提法、微波法、超聲波法、超臨界CO2提取法[12-16]，其中超聲波技術提取率高、操作簡單，適用于工廠進行在線檢測。靈芝發(fā)酵粉以谷物為基質發(fā)酵精制而成，產品中殘留的糖類物質會影響功能性多糖測定，故探索產品中三萜化合物含量的測定方法，為進一步控制靈芝發(fā)酵產品質量提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV754N紫外可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；TDL6M低速離心機：上海百典儀器設備有限公司；KQ-300GDV數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；RE-2000A旋轉蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；FW100微型高速萬能粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司。

靈芝發(fā)酵粉：山西瑞芝生物科技有限公司提供，是以谷物為發(fā)酵基質，接入靈芝液體菌種經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后精制而成。齊墩果酸標準品：安徽酷耳生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 標準曲線的繪制

參照陳飛等[17]的方法，以齊墩果酸標準品，于470 nm～800 nm處測定吸光度，發(fā)現(xiàn)在555 nm處測得的吸光度值最高，制得的標準曲線回歸方程為y=57.516X-0.011 4，R2=0.999 3。

1.2.2 靈芝發(fā)酵粉中三萜化合物的提取與測定

精確稱取樣品2.000 0 g，用95%乙醇80 mL浸泡100 min后，180 W、60℃超聲提取30 min，取出放冷，20℃下4 000 rpm離心10 min，留上清液減壓濃縮至5 mL，取1.00 mL到試管中，分別加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.30 mL、高氯酸1.00 mL，70℃水浴25 min，冷水浴中冷卻，超聲波輔助提取靈芝三萜化合物得率的影響，采用響應面Box-Behnken進行工藝優(yōu)化，確定最佳提取條件。響應面試驗因素水平表見表1。

表1 響應面因素水平表Table 1 Response surface factor level table

2 結果與分析

2.1 乙醇濃度對靈芝發(fā)酵粉中三萜化合物得率的影響

不同乙醇濃度對靈芝發(fā)酵粉中三萜化合物得率的影響情況見圖1。

圖1 乙醇濃度對靈芝發(fā)酵粉三萜得率的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of three terpene in Ganoderma lucidum fermented powder

采用超聲波輔助提取靈芝發(fā)酵粉中三萜化合物，提取溶劑選取乙醇，分別選擇55%、65%、75%、85%、95%和無水乙醇進行試驗。由圖1可以看出，隨著乙醇濃度的增加，三萜類化合物得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中95%乙醇提取得率最高。經(jīng)單因素方差分析發(fā)現(xiàn)。乙醇濃度對靈芝發(fā)酵粉三萜化合物的提取得率是有極顯著影響（p<0.01），因此本試驗采用95%乙醇進行提取。

2.2 浸泡時間對靈芝發(fā)酵粉中三萜得率的影響

浸提前期，乙醇浸泡時間對靈芝發(fā)酵粉中三萜得率的影響見圖2。

圖2 浸泡時間對靈芝發(fā)酵粉三萜得率的影響Fig.2 Effect of soaking time on the yield of three terpene in Ganoderma lucidum fermented powder

由圖2可以看出，當浸泡時間為100 min時，其三萜得率最高，為0.553 6 mg/g。低于100 min，靈芝三萜得率隨著浸泡時間的延長而升高，超過100 min則會逐漸下降。經(jīng)單因素方差分析得到（p<0.01），說明不同浸泡時間對靈芝發(fā)酵粉三萜化合物的提取得率是有極顯著影響的，因此，試驗采用浸泡時間為100 min。

2.3 料液比對靈芝發(fā)酵粉中三萜得率的影響

浸提時的料液比對靈芝發(fā)酵粉中三萜得率的影響見圖3。

圖3 料液比對靈芝發(fā)酵粉三萜得率的影響Fig.3 Effect of liqud to liquid ratio on the yield of three terpene in Ganoderma lucidum fermented powder

由圖3可知，三萜得率隨料液比的增加而升高，當料液比高于1∶40（g/mL）時，三萜得率出現(xiàn)下降趨勢，其原因可能為一定量的靈芝發(fā)酵粉中所加入提取劑過少時不利于三萜類化合物的溶出，當加入的提取劑不斷增加時，使得三萜化合物全部溶出。通過單因素方差分析得出（p<0.01），說明不同的料液比對靈芝發(fā)酵粉三萜化合物得率是有極顯著影響，當料液比為1 ∶40（g/mL）時，三萜含量達到最高值 0.551 4 mg/g，故選擇料液比為 1 ∶40（g/mL）。

2.4 超聲功率對靈芝發(fā)酵粉三萜得率的影響

不同超聲功率對靈芝發(fā)酵粉三萜的得率有一定影響，其結果見圖4。

圖4 超聲功率對靈芝發(fā)酵粉三萜得率的影響Fig.4 Effect of ultrasonic power on the yield of three terpene in Ganoderma lucidum fermented powder

由圖4可知，隨著超聲功率的不斷增加，三萜得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當超聲功率為210 W時，三萜得率達到最高值0.592 9 mg/g。經(jīng)方差分析，超聲功率為210 W時三萜得率顯著高于其他水平（p<0.05），故試驗選擇超聲功率為210 W。

2.5 超聲時間對靈芝發(fā)酵粉中三萜得率的影響

超聲處理的時間不同，對靈芝發(fā)酵粉中三萜得率的影響不同，測定結果見圖5。

圖5 超聲時間對靈芝發(fā)酵粉三萜得率的影響Fig.5 Effect of ultrasonic time on the yield of three terpene in Ganoderma lucidum fermented powder

由圖5可以看出，隨著超聲時間的不斷增加，靈芝發(fā)酵粉三萜得率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，當超聲時間為20 min時，三萜得率達到最高值，超過20 min三萜得率在逐漸下降。經(jīng)差異性顯著分析，超聲處理時間對三萜得率的影響顯著（p<0.01）故選擇提取時間為20 min。

2.6 超聲溫度對靈芝發(fā)酵粉三萜得率的影響

超聲處理的溫度對靈芝發(fā)酵粉中三萜化合物的提取也有一定的影響，其結果見圖6。

圖6 超聲溫度對靈芝發(fā)酵粉三萜得率的影響Fig.6 Effect of ultrasonic temperature on the yield of three terpene in Ganoderma lucidum fermented powder

由圖6可知，靈芝發(fā)酵粉三萜得率在超聲溫度為40℃時達到最大值，超過40℃時，三萜得率在明顯下降，表明在一定溫度范圍內，溫度越高越有利于靈芝發(fā)酵粉中三萜化合物的溶出，當溫度過高時，不利于三萜化合物的溶出，使提取得率降低。經(jīng)單因素方差分析可知（p<0.05），不同的超聲溫度下，三萜化合物的提取得率是有顯著差異的，說明超聲溫度對三萜得率是有顯著性影響的。因此超聲溫度選擇40℃。

2.7 響應面試驗結果

為了進一步考察各因素對靈芝發(fā)酵粉中三萜化合物提取得率的影響，在單因素試驗基礎上，選取料液比、超聲溫度、超聲時間、超聲功率作為考察因素，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，以靈芝發(fā)酵粉三萜得率作為響應值，采用四因素三水平進行響應面試驗，結果見表2。

表2 響應面設計及結果Table 2 Response surface design and results

2.7.1 模擬的建立及其顯著性檢驗

運用Design-Expert軟件對表2的試驗數(shù)據(jù)進行二次模擬回歸分析，以三萜得率為因變量，料液比、超聲溫度、超聲時間、超聲功率為自變量的二次多項回歸方程：

三萜得率＝0.58 ＋0.026A －4.717 ×10-3B －0.022C ＋0.022D＋0.036AB－0.022AC－2.750×10-4AD－0.041BC－2.750 ×10-4BD ＋0.018CD －0.086A2－0.044B2－0.063C2－0.10D2，二次多項回歸分析結果見表3

表3 回歸方程的方差分析結果Table 3 Variance analysis results of regression equation

由表3可知，模型p＜0.000 1，達到極顯著水平，失擬項p=0.487 4＞0.05，表示不顯著；即該模型對本試驗的擬合程度良好，可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系。其中R2=0.968 5，表明自變量和響應值之間的關系顯著，調整系數(shù)R2Adj=0.937 0，說明該模型能夠解釋93.70%的響應值變化，試驗誤差小，可以運用此模型對靈芝發(fā)酵粉三萜化合物提取進行分析和預測。一次項 A、C、D（p＜0.01）和二次項 A2、B2、C2、D2（p＜0.000 1），說明對響應值即靈芝發(fā)酵粉三萜得率的影響達到極顯著水平，AB、BC（p＜0.01），說明 A（料液比）與B（超聲溫度），B（超聲溫度）與C（超聲時間）交互作用極顯著，AC（p＜0.05）說明 A（料液比）與 C（超聲時間）交互作用顯著，說明各種試驗因子對因變量的影響不是簡單的線性關系。

2.7.2 響應面交互作用分析

為確定料液比、超聲溫度、超聲時間、超聲功率及其兩兩交互作用對靈芝發(fā)酵粉三萜化合物提取得率的影響，根據(jù)二次模擬回歸方程繪出響應面及等高線圖（圖7～圖12）。

圖7 料液比和超聲溫度對靈芝發(fā)酵粉三萜得率交互影響的三維曲面圖Fig.7 Three dimensionnal surface diagram of the interaction between solid-liquid ratio and ultrasonic temperature on the three terpene yield of Ganoderma lucidum fermentation powder

圖8 料液比和超聲時間對靈芝發(fā)酵粉三萜得率交互影響的三維曲面圖Fig.8 Three dimensionnal surface diagram of the interaction between solid-liquid ratio and ultrasonic power on the three terpene yield of Ganoderma lucidum fermentation powder

圖9 料液比和超聲功率對靈芝發(fā)酵粉三萜得率交互影響的三維曲面圖Fig.9 Three dimensionnal surface diagram of the interaction between solid-liquid ratio and ultrasonic time on the three terpene yield of Ganoderma lucidum fermentation powder

等高線的形狀反映交互效應的強弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則表示兩因素交互作用顯著[18]。

圖10 超聲溫度和超聲時間對靈芝發(fā)酵粉三萜得率交互影響的三維曲面圖Fig.10 Three dimensionnal surface diagram of the interaction between ultrasonic temperature and ultrasonic time on the three terpene yield of Ganoderma lucidum fermentation powder

圖11 超聲溫度和超聲功率對靈芝發(fā)酵粉三萜得率交互影響的三維曲面圖Fig.11 Three dimensionnal surface diagram of the interaction between ultrasonic temperature and ultrasonic power on the three terpene yield of Ganoderma lucidum fermentation powde

圖12 超聲時間和超聲功率對靈芝發(fā)酵粉三萜得率交互影響的三維曲面圖Fig.12 Three dimensionnal surface diagram of the interaction between ultrasonic time and ultrasonic power on the three terpene yield of Ganoderma lucidum fermentation powder

由圖7～圖12可以看出，有3個三維曲面圖為橢圓形，3個三維曲面圖為圓形，表明料液比和超聲溫度、料液比和超聲時間、超聲溫度和超聲時間的交互作用顯著，而料液比和超聲功率、超聲溫度和超聲功率、超聲時間和超聲功率交互作用不顯著。

2.7.3 最佳提取條件確定

利用Design-Expert軟件分析，得出靈芝發(fā)酵粉三萜化合物提取的最佳條件為：料液比=1∶42.53（g/mL），超聲溫度為42.97℃，超聲時間為16.99 min，超聲功率212.45 W，為便于試驗操作，調整條件為料液比=1∶42（g/mL）、超聲溫度 43 ℃、超聲時間 17 min、超聲功率210 W。重復3次驗證，三萜類化合物的平均得率為0.612 8 mg/g。

3 結論

影響超聲波法輔助提取三萜化合物的因素較多，試驗僅針對主要影響因素進行研究，在單因素試驗基礎上，確定浸提溶劑為95%乙醇，提前浸泡100 min，并運用Box-Behnken試驗設計對超聲波輔助提取工藝進行優(yōu)化，得到最佳工藝參數(shù)為：料液比1∶42（g/mL）、超聲溫度43℃、超聲時間17 min、超聲功率210 W，所得靈芝三萜類化合物的得率為0.612 8 mg/g。采用超聲波提取靈芝發(fā)酵粉中三萜化合物，不僅為產品質量檢驗提供的基礎，同時對活性物質的提取提供了指導作用。

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