鄭堅強，司俊玲，宋佳旭，李紅，吳曉宗，彭新榜

（鄭州輕工業(yè)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院，河南鄭州450002）

類胡蘿卜素（carotenoids）廣泛存在于各種果蔬中，是一種脂溶性天然色素的總稱。種類不同會呈現(xiàn)出不同顏色，通常為黃色、橙紅色或紅色，是著色能力強的天然色素，由于其具有安全性高、可靠性高、顏色自然等特點，因此受到食品行業(yè)青睞[1-2]。類胡蘿卜素一般由8個類異戊二烯單位組成，有抗氧化作用，同時還有抗癌、預(yù)防夜盲癥等功效[3-4]，人們對它的需求也越來越多。其中，類胡蘿卜素中的葉黃素的抗氧化活性較高[5]。由于類胡蘿卜素對光、熱、氧等條件比較敏感，穩(wěn)定性較差，所以對于類胡蘿卜素的萃取，從十九世紀(jì)以來一直是研究熱點，科技工作者始終致力于研究更好的萃取技術(shù)[6]。

微波輔助萃取法利用溫度將類胡蘿卜素更好的溶于溶劑中，有利于提高萃取得率。該方法不適宜揮發(fā)性較強的有機溶劑，微波輔助時間不宜過長[7]。采用超聲波輔助萃取可以使動植物細(xì)胞受到嚴(yán)重的損壞，提高細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的通透性，能夠促使細(xì)胞破裂進(jìn)而使細(xì)胞中的類胡蘿卜素更充分的溶在溶劑中，有助于類胡蘿卜素溶出[8-9]。

類胡蘿卜素的抗氧化機制主要有猝滅單線態(tài)氧、消除自由基、防止低密度脂蛋白氧化三種方式。類胡蘿卜素通過淬滅單線態(tài)氧，從而防止單線態(tài)氧引起的脂質(zhì)過氧化[10]。

枸杞中富含豐富的類胡蘿卜素。對枸杞中的類胡蘿卜素的萃取研究，為研究枸杞中小分子物質(zhì)做鋪墊，也可以將該方法運用在其他水果蔬菜中萃取天然色素，研究結(jié)果對色素的萃取提供研究參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 材料

枸杞（綠蒂品種，寧夏）：食品級，低溫貯藏。

1.1.2 試劑

無水乙醇、甲醇、石油醚、乙酸乙酯（分析純）：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；1-1-二苯基-2-苦基肼自由基：梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

MCR-3常壓微波輔助化學(xué)反應(yīng)器：上海予正儀器設(shè)備有限公司；WF-126高速多功能粉碎機：上海冰都電器有限公司；LY23-16S水浴鍋：上海麥尚科學(xué)儀器有限公司；SB25-12DTD超聲波萃取機：寧波新芝生物科技股份有限公司；NA 2SGS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：成都勝拓儀器有限公司：HC-02H真空泵：杭州海馳科技有限公司；V-1600PC紫外分光光度計：上海美普達(dá)儀器有限公司；FD-1真空冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；DLSB-5-20低溫冷卻循環(huán)泵：鄭州凱鵬實驗儀器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 枸杞冷凍干燥

采用真空冷凍干燥（真空度-0.20 MPa，冷凍干燥時間12 h，溫度-40℃），降低枸杞水分含量，處理后進(jìn)行粉碎。枸杞物料顆粒變小會增大枸杞和有機溶劑的接觸面積，能夠充分的與有機溶劑混合，有利于萃取，節(jié)約時間。粉碎時間約10 s。粉碎的枸杞粉末后裝入密封袋，低溫、避光貯藏。

1.2.2 類胡蘿卜素的萃取方法

1.2.2.1 微波輔助萃取法

微波輔助萃取法是在有機溶劑萃取法的基礎(chǔ)上，通過微波輔助處理的一種改進(jìn)方法。微波輔助萃取時，固定了240 W的微波輔助功率，萃取溫度分別為30、40、50 ℃；萃取時間分別為 5、10、15 min；料液比分別為 1∶10、1∶15、1∶20（g/mL）。然后按照響應(yīng)優(yōu)化設(shè)計進(jìn)行試驗。萃取溶液進(jìn)行抽濾，然后定容500 mL的容量瓶中，在450 nm處測定其吸光度，按照公式1的計算萃取的類胡蘿卜素含量[10]。

式中：M為萃取的類胡蘿卜素的含量，mg/100g；A為在450 nm測得的類胡蘿卜素的吸光度；v為樣品液定容體積，mL；n為稀釋定容后的倍數(shù)；m1為實際稱取的枸杞質(zhì)量，g；2 480為1 cm光程長的比色杯中1 g/L枸杞樣品萃取液的理論吸收值（按玉米黃素記）。

1.2.2.2 超聲波萃取法

試驗中溫度和時間兩個因素。溫度為30、40、50℃；萃取時間為5、10、15 min。萃取溶液定容，測定其吸光度，按照公式1的計算類胡蘿卜素的含量。

1.2.2.3 抗氧化活性的測定

1）DPPH溶液的配置：準(zhǔn)確稱取DPPH粉末3.94mg，加入具塞棕色錐形瓶中，加入100.00 mL無水乙醇，搖勻，得到濃度為0.1 mmol/L的DPPH乙醇溶液。避光貯存。

2）DPPH自由基清除率的測定：準(zhǔn)備4個試管，分別標(biāo)注A樣品、A對照、A空白。吸取配置DPPH溶液2.00 mL分別加入A樣品和A對照試管中，再吸取2.00 mL無水乙醇溶液分別加入A空白和空白試管中，吸取萃取樣品溶液2.00 mL分別加入A樣品和A空白試管中，振蕩后置于暗處反應(yīng)30 min后，在517 nm處分別測定A樣品、A空白、A對照的吸光度。然后根據(jù)公式2計算出萃取的類胡蘿卜素的自由基清除率K，表明類胡蘿卜素的抗氧化活性效果[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 萃取液的配比對萃取類胡蘿卜素的影響

不同濃度的萃取液對萃取枸杞中類胡蘿卜素的含量結(jié)果，如圖1所示。

圖1 不同有機溶液的配比對萃取類胡蘿卜素影響Fig.1 Effect of different organic solutions on extraction of carotenoids

從圖1看出，甲醇∶無水乙醇為2∶1（體積比）時效果較差，隨著無水乙醇、比重越大，有機溶劑萃取的效果越好。當(dāng)甲醇∶無水乙醇=1∶2（體積比）時基本穩(wěn)定，并且發(fā)現(xiàn)，再增加無水乙醇的比重，萃取效果沒有明顯變化。

2.1.2 料液比對萃取類胡蘿卜素的影響

不同料液比對萃取類胡蘿卜素含量的影響結(jié)果，如圖2所示。

圖2 不同料液比對萃取類胡蘿卜素含量的影響結(jié)果Fig.2 Effect of different ratio of solid to liquid on the extraction of carotenoids

如圖2 所示，料液比在 1 ∶10（g/mL）到1 ∶15（g/mL）之間效果最好。料液比為1∶5（g/mL）時有機溶劑較少，枸杞較多，萃取的類胡蘿卜素達(dá)到飽和，枸杞中還有部分類胡蘿卜素沒有溶解到有機溶劑中，造成萃取損失。當(dāng)料液比在1∶20（g/mL）之后，由于有機溶劑的增加，與枸杞接觸的有機溶劑也隨之增加，增大萃取的含量，但溶劑過多，造成枸杞與有機溶劑接觸不完全，有機溶劑越多，揮發(fā)越大，所以在料液比1∶20（g/mL）之后萃取效果反而下降。

2.1.3 萃取時間對萃取類胡蘿卜素的影響

萃取時間對萃取枸杞中的類胡蘿卜素的影響結(jié)果，如圖3所示。

圖3 不同萃取時間對萃取類胡蘿卜素含量的影響結(jié)果Fig.3 The effect of different extraction time on the extraction of carotenoids content results

由圖3看出，隨著萃取時間的增加，萃取類胡蘿卜素呈上升后下降的趨勢。時間越長，由于有機溶劑的揮發(fā)會導(dǎo)致萃取效果下降。

其實，這跟年歲一點關(guān)系都沒有。央視有個足球評論員叫張路，說球說了三十多年。我小時候，他就在激情澎湃地說意甲，如今還在激情澎湃地說球，一口氣說出那么多球員的名字，這得多好的記憶力啊。老了的張路先生，依然顯得年輕，依然帥氣，也只有活在自我情趣中的人，才會這么年輕吧。

2.1.4 萃取溫度對萃取類胡蘿卜素的影響

萃取溫度對萃取枸杞中類胡蘿卜素的影響結(jié)果，如圖4所示。

由圖4看出，隨著溫度的升高，萃取的類胡蘿卜素的含量也逐漸增加。但考慮到有機溶劑的沸點、易揮發(fā)性，試驗選擇60℃。溫度越高分子的擴散速度越快，分子的運動也加劇，所以溫度越高萃取效果越好。

圖4 不同萃取溫度對萃取類胡蘿卜素的含量的影響結(jié)果Fig.4 Different extraction temperature on the extraction of carotenoids results

2.2 響應(yīng)面設(shè)計微波輔助萃取試驗結(jié)果

采用Design-Expert 8.0軟件中的中心組合試驗（box-behnken design，BBD）原理。選取微波輔助萃取時間（min）、溫度（℃）、料液比（g/mL），以測得的類胡蘿卜素含量為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面試驗，見表1。

表1 微波輔助萃取響應(yīng)面分析法的因素與水平表Table 1 Microwave extraction response surface analysis of the factors and level table

得到萃取的類胡蘿卜素含量對萃取溫度（℃）、萃取時間（min）、料液比（g/mL）的回歸方程類胡蘿卜素含量=66.60+0.31X1-0.052X2-0.54X3-1.16X1X2-0.80X1X3+1.67X2X3-1.92X12-2.27X22-2.9X32

表2 試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)分析Table 2 Experimental design and data analysis

續(xù)表2 試驗設(shè)計與數(shù)據(jù)分析Continue table 2 Experimental design and data analysis

模型中二次項中X32較為顯著，表明模型中萃取的溫度對萃取枸杞中的類胡蘿卜素有較顯著的影響。表中P失擬項＜0.05說明模擬失擬度較為顯著。模型中的調(diào)整確定系數(shù)RAdj=0.953 4，說明該模型能解釋95.34%響應(yīng)值的變化。得出的優(yōu)化最佳條件為萃取時間 10 min，萃取溫度 45 ℃，料液比 1 ∶15（g/mL），測得類胡蘿卜素含量為69.05 mg/100 g，優(yōu)化條件下的萃取含量略微提升。

表3 微波輔助萃取方差分析表Table 3 Microwave extraction analysis of variance table

固定料液比時，溫度與時間的交互作用對萃取類胡蘿卜素的影響見圖5。

圖5 溫度和時間響應(yīng)曲面圖Fig.5 Surface map of temperature and time response

圖6 料液比與時間響應(yīng)曲面圖Fig.6 Liquid ratio and time response surface map

從圖6中可以看出，在萃取溫度固定時，料液比與時間對萃取枸杞中類胡蘿卜素含量的影響作用。在料液比固定時，隨著時間的增加，類胡蘿卜素萃取的含量也增加。在時間固定時，隨著料液比的增加，類胡蘿卜素的含量呈先上升后下降的趨勢。料液比與時間對提取類胡蘿卜素含量的影響見圖7。

圖7 料液比與溫度響應(yīng)曲面圖Fig.7 Liquid ratio and temperature response surface

從圖7中可以觀察出，在萃取時間固定時，料液比與溫度的交互作用下對萃取枸杞中類胡蘿卜素的影響。在萃取時間固定時，料液比不變時，隨著萃取溫度的升高，萃取的類胡蘿卜素含量先上升后下降。在萃取溫度不變時，隨著料液比的增加萃取的類胡蘿卜素含量下降。

2.3 超聲波萃取結(jié)果

按照1.2.2.2方法，采用超聲波輔助萃取，萃取得到的類胡蘿卜素含量結(jié)果如表4所示。

表4 超聲波萃取類胡蘿卜素含量結(jié)果Table 4 The result of ultrasonic extraction of carotenoid content

從表4可以看出，隨著時間的增加萃取的類胡蘿卜素含量呈現(xiàn)一個上升的趨勢。在萃取時間不變時，隨著萃取溫度的提升，萃取的含量也明顯增加。

2.4 自由基清除率的測定結(jié)果

按照1.2.2.3方法，采用微波輔助萃取法 [工藝參數(shù)：萃取溫度45℃，萃取時間10 min，料液比1∶15（g/mL），甲醇 ∶無水乙醇（體積比）=1∶2]，獲得類胡蘿卜素的自由基清除率為95.22%，而采用超聲波萃取法[技術(shù)參數(shù)：萃取溫度50℃，萃取時間15 min，料液比1 ∶15（g/mL），甲醇 ∶無水乙醇（體積比）=1∶2]，獲得類胡蘿卜素的自由基清除率為89.46%。主要原因是超聲波作用下，產(chǎn)生了“空化現(xiàn)象”，水分子裂解產(chǎn)生了H·和OH·等自由基，加速了類胡蘿卜素的氧化進(jìn)程。

3 結(jié)論

試驗在單因素的基礎(chǔ)上通過正交試驗、響應(yīng)面優(yōu)化試驗可以得到最適合萃取類胡蘿卜素的工藝條件。通過響應(yīng)優(yōu)化試驗，得出微波輔助萃取最佳條件為：萃取溫度45℃，萃取時間 10 min，料液比 1∶15（g/mL），甲醇∶無水乙醇（體積比）=1∶2（體積比）。

通過抗氧化活性的測定，微波輔助萃取法得到的類胡蘿卜素自由基清除率為95.22%。表明枸杞中類胡蘿卜素具有很好的抗氧化能力，研究數(shù)據(jù)進(jìn)一步說明了枸杞中類胡蘿卜素作為抗氧化活性物質(zhì)，具有很好應(yīng)用前景。

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