肖冬來，張 迪，林衍銓，楊 菁

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，福建 福州 350014）

香菇（Lentinula edodes）是世界第二大宗食用菌，其產(chǎn)量僅次于雙孢蘑菇（Agaricus bisporus），而我國是香菇生產(chǎn)第一大國。香菇具有抗腫瘤、預(yù)防心血管疾病、免疫增強等功效[1－3]，是具有極高應(yīng)用價值的食（藥）用菌之一。香菇屬于木腐菌中的白腐菌，通過分解腐木中的木質(zhì)纖維素為其生長提供營養(yǎng)成分。參與木質(zhì)素降解的過氧化物酶主要有木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶和漆酶，纖維素降解酶系主要包括羧甲基纖維素酶、濾紙纖維素酶和β－葡萄糖苷酶。目前，對香菇胞外酶活性、不同時期胞外酶的表達(dá)動態(tài)的研究較多[4－5]，而金屬離子對香菇胞外酶活性影響的研究相對較少[6－7]。為此本文分析了6種常見金屬離子對香菇羧甲基纖維素酶、漆酶和木質(zhì)素過氧化物酶活性的影響，為通過添加金屬離子提高香菇胞外酶活性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試的香菇菌株L236為福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所保藏。

1.2 主要試劑與儀器

3，5-二硝基水楊酸（DNS）、2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）、二銨鹽（ABTS）、亞甲基藍(lán)、96孔板，購自上海生工生物技術(shù)有限公司。氯化鉀、氯化鈉、無水氯化鈣、七水硫酸亞鐵、一水硫酸錳、六水氯化鎂等，均為國產(chǎn)分析純。Biotek Epoch 2型微孔板分光光度計，購自美國伯騰儀器有限公司。

1.3 菌絲培養(yǎng)

香菇菌絲培養(yǎng)基配方：木屑80%、麩皮18%、蔗糖1%、石膏1%，含水量60%。菌包在23℃下黑暗培養(yǎng)30 d，菌絲生長至滿袋。

1.4 粗酶液制備和相對酶活比較

取菌絲培養(yǎng)物50 g，加入250 mL去離子水，放置于4℃冰箱浸提16 h，用4層紗布過濾后，濾液于4℃、3 000 g離心15 min，所得上清即為粗酶液。在粗酶液中分別添加不同濃度的Na+、K+、Ca2+、Mn2+、Fe2+、Mg2+金屬離子，室溫放置30 min后用于酶活測定。設(shè)定未添加金屬離子的酶活性為100%，加入金屬離子的酶活性折算成相對酶活，比較金屬離子對酶活性的影響，每個處理重復(fù)3次取平均值。

1.5 羧甲基纖維素酶活性測定

取 400 μL 用 pH 4.6、0.1 mol·L-1醋酸鹽緩沖液配制的0.5%羧甲基纖維素鈉、粗酶液100 μL（添加不同濃度的金屬離子），混勻后45℃水浴1 h，然后立即加入375 μL DNS溶液沸水浴10 min，冷卻后加入去離子水稀釋10倍，取200 μL利用微孔板分光光度計檢測520 nm處的吸光值。以沸水浴滅活的添加不同濃度金屬離子粗酶液作對照，用吸光值的變化來表示酶活性的變化。

1.6 漆酶活性測定

取 500 μL 用 pH 4.0，0.2 mol·L-1醋酸鹽緩沖液配制的0.5 mmol·L-1ABTS溶液、粗酶液500 μL（添加不同濃度的金屬離子），混勻后30℃反應(yīng)3 min，取200 μL利用微孔板分光光度計檢測420 nm處的吸光值。以沸水浴滅活的添加不同濃度金屬離子粗酶液作為對照，用吸光值的變化來表示酶活性的變化。

1.7 木質(zhì)素過氧化物酶活性測定

木質(zhì)素過氧化物酶的測定參考祝子坪等[8]的方法，取200 μL反應(yīng)液利用微孔板分光光度計檢測664 nm處的吸光值。以去離子水代替H2O2的反應(yīng)體系作為對照，用吸光值的變化來表示酶活性的變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種金屬離子對香菇羧甲基纖維素酶的影響

不同濃度金屬離子對羧甲基纖維素酶的影響見圖1。

圖1 不同濃度金屬離子對羧甲基纖維素酶的影響Fig.1 Influence of different metal ions on carboxymethyl cellulase activity

從圖1中可以看出，相比不添加金屬離子的空白對照 CK，Na+、K+、Ca2+、Mn2+、Fe2+、Mg2+對香菇羧甲基纖維素酶具有不同的激活效果，其中Na+、Ca2+、Fe2+對羧甲基纖維素酶激活效果較小，僅1 mmol·L-1Fe2+時最大可提升約10%。K+激活作用最明顯，在1 mmol·L-1時酶活性提高了53%，其次為10 mmol·L-1Mg2+和 10 mmol·L-1Mn2+，分別可提高酶活性43%和31%。

2.2 6種金屬離子對香菇漆酶的影響

不同濃度金屬離子對漆酶的影響見圖2。

圖2 不同濃度金屬離子對漆酶的影響Fig.2 Influence of different metal ions on laccase activity

從圖2中可以看出，不同濃度的Fe2+對漆酶活性均具有顯著的抑制作用。較高濃度（10 mmol·L-1和5 mmol·L-1）的Na+、K+、Ca2+也可抑制漆酶活性，1 mmol·L-1和 0.5 mmol·L-1時對酶活性影響不明顯。Mn2+和Mg2+在4個濃度下，對漆酶活性的影響均不明顯。

2.3 6種金屬離子對香菇木質(zhì)素過氧化物酶的影響

不同濃度金屬離子對木質(zhì)素過氧化物酶的影響見圖3。

圖3 不同濃度金屬離子對木質(zhì)素過氧化物酶的影響Fig.3 Influence of different metal ions on lignin peroxidase activity

從圖3中可以看出，Na+在10 mmol·L-1和0.5 mmol·L-1時，對木質(zhì)素過氧化物酶具有激活作用，分別可提高酶活性56%和42%。而不同濃度的K+、Ca2+、Mn2+、Fe2+、Mg2+，對香菇木質(zhì)素過氧化物酶均具有抑制作用。

3 結(jié)論與討論

Na+、K+、Ca2+、Mn2+、Fe2+、Mg2+對香菇羧甲基纖維素酶具有不同的激活作用，其中K+、Mn2+和Mg2+激活效果較顯著。金屬離子對纖維素酶的影響往往因纖維素酶的不同來源而產(chǎn)生差異，如Mn2+對綠色木酶（Trichoderma viride）纖維素酶具有抑制作用[9]，而對飼用纖維素酶卻具有較強的激活作用[10]。Fe2+可抑制漆酶活性，Na+、K+、Ca2+、Mn2+、Mg2+對漆酶的激活作用均不明顯，這與王方忠[6]等的研究結(jié)果相似。漆酶屬于多銅氧化酶，其催化中心含有多個銅離子，Cu2+可顯著提高漆酶活性。除Na+對木質(zhì)素過氧化物酶有激活作用外，K+、Ca2+、Mn2+、Fe2+、Mg2+均可不同程度地抑制香菇木質(zhì)纖維素酶活性。

本研究僅分析了6種金屬離子對香菇羧甲基纖維素酶、漆酶和木質(zhì)素過氧化物酶活性的影響，未對淀粉酶、濾紙纖維素酶、葡萄糖苷酶、錳過氧化物酶等其他胞外酶活性的影響進(jìn)行分析，且金屬離子種類眾多，不同金屬離子對不同胞外酶活性的影響效果不一致，因此還需進(jìn)一步開展金屬離子對香菇胞外酶系影響的系統(tǒng)研究。

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