楊冬靜,孫厚俊,張成玲,徐 振,趙永強(qiáng),謝逸萍

(江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部甘薯生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 徐州 221131)

【研究意義】隨著人們生活水平的提高和膳食結(jié)構(gòu)的不斷改善，甘薯已不僅僅是重要的糧食和工業(yè)原料作物[1]，日本、歐洲以及美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)更把甘薯視為營(yíng)養(yǎng)平衡全面的保健食品[2]，甘薯富含花青素、胡蘿卜素、可溶性膳食纖維、糖蛋白以及多種礦物質(zhì)成分，具有增強(qiáng)免疫功能、防癌抗癌以及抗衰老等多種功效，被許多專家認(rèn)為是21世紀(jì)最理想的食物之一[3]。我國(guó)是世界上最大的甘薯生產(chǎn)國(guó)家，甘薯常年種植面積約560萬hm2，約占世界甘薯種植面積的53.5 %。甘薯黑斑病(black rot)又名黑疤病，在世界各甘薯產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生，也是我國(guó)北方薯區(qū)三大病害之一，每年我國(guó)由該病導(dǎo)致甘薯產(chǎn)量損失為5 %～10 %，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可達(dá)20 %～50 %。甘薯黑斑病病原物為甘薯長(zhǎng)喙殼菌(CeratocystisfimbriataEllis et Halsted)，屬于子囊菌亞門長(zhǎng)喙殼屬真菌，可為害甘薯幼苗莖基部，主要表現(xiàn)為莖基部長(zhǎng)出黑褐色橢圓形或菱形病斑，稍凹陷，高濕條件下可產(chǎn)生黑色刺毛狀及粉狀物，造成薯苗受害；該病原菌也可侵染甘薯塊根組織[4]，導(dǎo)致甘薯黑皰霉酮等呋喃萜類有毒物質(zhì)的產(chǎn)生，目前我國(guó)已有較多關(guān)于人畜食用黑斑病侵染后薯塊產(chǎn)生中毒癥狀的報(bào)道[5]。黑斑病的防控已成為我國(guó)甘薯產(chǎn)業(yè)面臨的重要問題之一。【前人研究進(jìn)展】目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于甘薯黑斑病研究主要包括黑斑病抗性鑒定方法[6-7]、抗病品種篩選[8-9]以及室內(nèi)化學(xué)藥劑的篩選[10-12]等方面。國(guó)外Hong等(2016)[13]首次報(bào)道了一種內(nèi)生細(xì)菌紅球菌KB6可提高甘薯品種對(duì)黑斑病的抗性，而我國(guó)目前還未見針對(duì)甘薯黑斑病的生防菌株篩選和應(yīng)用的報(bào)道。解淀粉芽孢桿菌是目前研究報(bào)道較多的一種生防菌，具有繁殖迅速，對(duì)人畜無毒無害，與環(huán)境友好，且可產(chǎn)生芽孢并由此具有較強(qiáng)的耐逆性，并由此得到廣泛的生產(chǎn)和應(yīng)用，如德國(guó)ABiTEP GmbH 公司已將解淀粉芽孢桿菌BacillusamyloliquefaciensFZB42登記并產(chǎn)業(yè)化[14]。【本研究切入點(diǎn)】本課題組前期通過分離篩選鑒定獲得一株具有廣譜抗真菌活性的解淀粉芽孢桿菌菌株XZ-1，本文擬進(jìn)一步測(cè)定該菌株對(duì)甘薯黑斑病菌的拮抗活性以及對(duì)薯塊黑斑病的防治效果?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為甘薯黑斑病的防控提供新方法新思路，為甘薯綠色生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 生防細(xì)菌 解淀粉芽孢桿菌菌株XZ-1由江蘇徐淮地區(qū)徐州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所甘薯病蟲害防控課題組分離篩選自江蘇省徐州市銅山區(qū)班井村甘薯種植地，經(jīng)過純化后采用甘油保存于-20 ℃冰箱。

1.1.2 病原真菌 供試病原菌甘薯黑斑病菌經(jīng)分離鑒定后保存于4 ℃冰箱。

1.1.3 培養(yǎng)基 甘薯黑斑病菌的培養(yǎng)采用PDA培養(yǎng)基(土豆20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉15 g/L，水1000 mL)；解淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)采用LBA培養(yǎng)基(胰蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，氯化鈉10.0 g/L)，LB培養(yǎng)基為L(zhǎng)BA培養(yǎng)基中不加瓊脂。配置好的培養(yǎng)基于121 ℃高壓滅菌鍋(Zealway GR85DA，America) 20 min后備用。

1.2 XZ-1發(fā)酵液對(duì)甘薯黑斑病菌的拮抗活性測(cè)定

將XZ-1在LBA平板中劃線活化后，挑取單菌落于27 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)36 h后備用。采用平板對(duì)峙法，在PDA平板中央接種蘸取上述菌液的無菌濾紙片，在濾紙片左右分別接種黑斑病病菌菌碟，以蘸取LB液體培養(yǎng)基的濾紙片在PDA平板中心作為對(duì)照，每個(gè)處理都設(shè)置3個(gè)重復(fù)，將處理好的平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，大約4 d左右對(duì)照中兩病原菌菌絲交接時(shí)，記錄抑菌帶直徑并拍照。

1.3 XZ-1對(duì)黑斑病菌菌絲形態(tài)和產(chǎn)孢的影響

取載玻片加1滴滅菌水，用滅菌的接種針從1.2的平板菌落邊緣挑取少量菌絲，置于載玻片上，加蓋玻片后，置于倒置顯微鏡(Leica DMILLED，Germany)下觀察菌絲形態(tài)以及產(chǎn)孢情況，并于40×物鏡下拍照記錄，以1.2中未XZ-1發(fā)酵液的平板中挑取的菌絲形態(tài)為對(duì)照。

1.4 XZ-1發(fā)酵濾液對(duì)黑斑病菌孢子萌發(fā)的影響

取制備好的發(fā)酵濾液，用22 μm孔徑的無菌濾器過濾，采用滅菌培養(yǎng)皿收集XZ-1發(fā)酵濾液，將培養(yǎng)好的黑斑病菌平板中的孢子洗脫鏡檢后，取500 μl孢子懸浮液加入發(fā)酵濾液后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h左右取出，采用倒置顯微鏡(Leica DMILLED，Germany)觀察孢子萌發(fā)狀況，并于40×物鏡下拍照記錄，以清水處理的孢子作為對(duì)照。

1.5 XZ-1對(duì)薯塊黑斑病的防治

1.5.1 薯塊的獲得 采收后的薯塊經(jīng)高溫愈合后，選取大小均勻無病無蟲的徐薯32薯塊，每處理3個(gè)薯塊，將取好的薯塊洗凈晾干，再用75 %酒精均勻噴霧消毒后自然晾干，備用。

1.5.2 黑斑病菌孢子懸浮液的制備 將培養(yǎng)好的黑斑病菌平板取出，用無菌水洗脫孢子，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子濃度并稀釋到約為5.0×105CFU/mL，將制備好的孢子懸浮液置于培養(yǎng)皿中備用。

1.5.3 防治效果方案設(shè)置 共設(shè)置5個(gè)處理，分別為A：清水對(duì)照；B：XZ-1發(fā)酵原液；C：XZ-1發(fā)酵液10× 稀釋液；D：XZ-1發(fā)酵液100× 稀釋液；E：對(duì)照藥劑多菌靈1600倍稀釋液，每個(gè)處理分別噴3個(gè)薯塊，待噴藥后的薯塊晾干以后接種黑斑病菌孢子液。

1.5.4 薯塊黑斑病的接種及發(fā)病 用滅菌好的針頭長(zhǎng)度為0.5 cm的接種針蘸配好的黑斑病菌孢子懸浮液，垂直扎測(cè)試的薯塊，每個(gè)薯塊接種3排，每排5個(gè)點(diǎn)，每扎1次蘸1次菌液，將接種好的薯塊裝入消毒的周轉(zhuǎn)箱中，加蓋消毒紗布保濕，置于約為26 ℃的恒溫室中，每天往保濕紗布上噴水保濕。培養(yǎng)10 d后，切開薯塊測(cè)量病斑直徑和深度，計(jì)算病斑體積，并計(jì)算防治效果，防效計(jì)算公式如下：防治效果( %) = (對(duì)照病斑體積-處理病斑體積)/對(duì)照病斑體積× 100 %。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用DPS.05軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，應(yīng)用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 XZ-1發(fā)酵液對(duì)甘薯黑斑病菌的拮抗活性測(cè)定

28 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d后對(duì)照中的兩黑斑病菌菌碟交接，取出平板觀察發(fā)現(xiàn)XZ-1發(fā)酵液對(duì)甘薯黑斑病菌有明顯的拮抗活性(圖1)。經(jīng)測(cè)量，抑菌帶平均直徑為25.3 mm。

2.2 XZ-1發(fā)酵液對(duì)黑斑病菌菌絲形態(tài)及產(chǎn)孢的影響

如圖2所示，未見XZ-1發(fā)酵液對(duì)黑斑病菌菌絲有明顯的致膨大或致畸等作用；但從圖3的菌絲產(chǎn)孢情況來看，從菌落邊緣挑出的菌絲產(chǎn)生的孢子發(fā)生了明顯改變，圖3-A中未經(jīng)處理的菌絲產(chǎn)生的孢子主要為分生孢子，而圖3-B中經(jīng)XZ-1處理后的菌絲產(chǎn)生的孢子主要為厚垣孢子。

2.3 XZ-1發(fā)酵液對(duì)黑斑病菌產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的影響

發(fā)酵液處理6 h后取出平板，顯微觀察孢子萌發(fā)狀況，如圖4所示，清水處理的孢子已正常萌發(fā)并產(chǎn)生芽管，而XZ-1處理的孢子并未萌發(fā)，說明XZ-1可明顯抑制黑斑病菌孢子的萌發(fā)。

圖1 XZ-1 對(duì)甘薯黑斑病菌的拮抗活性測(cè)定Fig.1 Analysis of antibiotic activity of XZ-1 against Ceratocystis fimbriata

A為對(duì)照未處理的菌絲；B為XZ-1發(fā)酵液處理后的菌絲A: Hyphae treated by water; B: Hyphae treated by XZ-1 fermentation圖2 XZ-1發(fā)酵液對(duì)甘薯黑斑病菌菌絲形態(tài)的影響Fig.2 Effects of fermentation liquid of XZ-1 on hyphae morphology of Ceratocystis fimbriata

A為對(duì)照未處理的黑斑病菌的產(chǎn)孢情況； B為XZ-1發(fā)酵液處理后的黑斑病菌的產(chǎn)孢情況A: Sporulation type which treated by water; B: Sporulation type which treated by XZ-1 fermentation圖3 XZ-1發(fā)酵液對(duì)甘薯黑斑病菌產(chǎn)孢的影響Fig.3 Effects of fermentation liquid of XZ-1 on sporulation of Ceratocystis fimbriata

A為滅菌水處理的黑斑病菌孢子萌發(fā)情況； B圖XZ-1發(fā)酵液處理后黑斑病菌孢子萌發(fā)情況4: Spores germinate normally in water; B: Spores nearly ungerminated in XZ-2 fermentation圖4 XZ-1發(fā)酵液對(duì)甘薯黑斑病菌孢子萌發(fā)的影響Fig.4 Effects of fermentation liquid of XZ-1 on spores germination of Ceratocystis fimbriata

2.4 XZ-1發(fā)酵液對(duì)薯塊黑斑病的防治

10 d后取出薯塊，拍照記錄薯塊的發(fā)病情況(圖5)，B、C、D中XZ-1 3種不同濃度的發(fā)酵液處理的薯塊表面的病斑直徑明顯小于對(duì)照中薯塊的病斑直徑，而對(duì)照藥劑多菌靈處理的薯塊表面病斑直徑比XZ-1各濃度處理的要大，比對(duì)照要小。

如表1所示，清水對(duì)照處理的薯塊黑斑病發(fā)病體積高達(dá)35.08 mm3，而XZ-1原液處理的薯塊黑斑病發(fā)病體積僅為12.64 mm3，XZ-1 10×稀釋液處理的薯塊黑斑病發(fā)病體積為13.84 mm3，XZ-1 10×稀釋液處理的薯塊黑斑病發(fā)病體積為15.75 mm3，3種不同濃度的XZ-1發(fā)酵液處理的薯塊黑斑病發(fā)病體積均與對(duì)照病斑體積呈極顯著水平差異；而多菌靈處理的薯塊發(fā)病體積為26.00 mm3，與對(duì)照沒有顯著性差異，與3種濃度的XZ-1發(fā)酵液處理后病斑體積呈顯著差異。從防治效果來看，XZ-1 3種從高到低濃度的發(fā)酵液對(duì)黑斑病的防治效果也是從高到低，分別為65.02 %，58.19 %和54.14 %，而多菌靈1600倍液處理對(duì)黑斑病防治效果僅為23.99 %，XZ-1 3種不同濃度的發(fā)酵液對(duì)黑斑病的防效與多菌靈對(duì)黑斑病的防效呈極顯著水平差異。

圖5 XZ-1發(fā)酵液對(duì)薯塊黑斑病的生物防治效果Fig.5 Biological control efficacy of XZ-1 fermentation against black rot of sweet potato on the storage roots

處理 Treatments 平均病斑體積(mm3) Anverage disease volume平均防效( %) Anverage control efficacy清水對(duì)照 Control (water)35.08±3.38 AaXZ-1原液 XZ-1 initial fermentation12.64±3.27 Bb65.02±5.86AaXZ-1 10×稀釋液 10 × diluent of XZ-1 initial fermentation13.84±3.39 Bb58.19±12.65 AaXZ-1 100×稀釋液 100 × diluent of XZ-1 initial fermentation15.75±1.84 Bb54.14±6.66 Aa多菌靈 1600倍液 1600 × diluent of carbendazim26.00±0.86 ABa23.99±9.6 0Ab

注：不同大寫字母表示經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)在P<0.05水平差異顯著；不同小寫字母表示經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)在P<0.01水平差異顯著。

Note: Data in the table were mean ± SD. Different capital letters indicate significant difference atP<0.05 level by Duncan’s new multiple range test; Different lower case letters indicate significant difference atP<0.01 level by Duncan’s new multiple range test.

3 討 論

采用平板對(duì)峙等方法研究解淀粉芽孢桿菌菌株XZ-1甘薯黑斑病菌的生物防治效果，表明該菌株對(duì)黑斑病菌具有較強(qiáng)的拮抗活性，通過菌絲形態(tài)顯微觀察尚未發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)黑斑病菌菌絲有明顯抑制作用，這與其他一些生防菌株可導(dǎo)致病原菌菌絲腫脹、畸形、原生質(zhì)濃縮等報(bào)道有所差異[16-17]，這可能是由于各生防菌株產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)類型不同，其作用方式和作用機(jī)理也相應(yīng)的有所差異。該菌株對(duì)黑斑病菌產(chǎn)孢類型有較大的影響，黑斑病菌可產(chǎn)生3種孢子：分生孢子、厚垣孢子和子囊孢子[18]，分生孢子在正常條件可隨時(shí)萌發(fā)出牙管，牙管頂端再長(zhǎng)出次生內(nèi)孢子然后生成菌絲，而厚垣孢子具有厚壁，需要經(jīng)過一段時(shí)間休眠后才可萌發(fā)，本文中經(jīng)XZ-1處理的菌絲產(chǎn)生了大量厚垣孢子，推測(cè)這是黑斑病菌對(duì)XZ-1的一種抵御機(jī)制。薯塊的防治效果試驗(yàn)結(jié)果表明不同濃度的XZ-1發(fā)酵液對(duì)均可顯著降低薯塊黑斑病的發(fā)病體積，其中發(fā)酵原液處理后薯塊的病斑體積最小，僅為12.64 mm3；XZ-1 10 × 稀釋液和XZ-1 100 × 稀釋液處理的薯塊黑斑病發(fā)病體積13.84和15.75 mm3；而多菌靈處理的薯塊黑斑病發(fā)病體積為26.00 mm3，統(tǒng)計(jì)分析表明3種不同濃度XZ-1發(fā)酵液處理的薯塊黑斑病發(fā)病體積均與對(duì)照病斑體積呈極顯著差異；而多菌靈處理的薯塊與對(duì)照薯塊發(fā)病體積沒有顯著性差異。從防效來看，XZ-1原液對(duì)薯塊黑斑病的防治效果最佳，為65.02 %；XZ-1 10 × 稀釋液和XZ-1 100 × 稀釋液的防治效果僅次于原液，分別為58.19 %和54.14 %，但3種濃度的XZ-1發(fā)酵液對(duì)薯塊黑斑病的防治效果沒有顯著性差異，而多菌靈1600倍液處理對(duì)黑斑病防治效果僅為23.99 %，XZ-1 3種不同濃度的發(fā)酵液對(duì)黑斑病的防效與多菌靈對(duì)黑斑病的防效呈極顯著水平差異，說明XZ-1對(duì)儲(chǔ)藏期甘薯黑斑病具有較好的防治效果，是一株具有較好應(yīng)用前景的生防菌株。

已有的報(bào)道表明，生防菌的防治機(jī)理有產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)[19]、營(yíng)養(yǎng)位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)、對(duì)作物根際微生態(tài)的改善[20]、防御相關(guān)酶活性增強(qiáng)[21]以及誘導(dǎo)植物抗病性產(chǎn)生[22]等。XZ-1是本課題組從甘薯根際土壤中分離篩選鑒定所得，因此該菌株是否可以定殖在甘薯植株體內(nèi)，該菌株是否可以改善甘薯根際微生態(tài)，緩解植物自身的化感作用，該菌株是否可以誘導(dǎo)甘薯產(chǎn)生抗病性等這些都值得我們進(jìn)一步深入的研究，也是下一步課題組將要開展的研究工作，這將為甘薯黑斑病生防菌劑的開發(fā)提供理論依據(jù)，為甘薯綠色防控作出重要貢獻(xiàn)。

4 結(jié) 論

甘薯作為保證我國(guó)糧食安全的底線作物、抗災(zāi)救災(zāi)的先鋒作物、生物質(zhì)能源原材料和保健的最佳食品[15]，越來越受到人們的關(guān)注。但近年來由于全球氣候異常，我國(guó)江淮薯區(qū)甘薯生長(zhǎng)季節(jié)高溫高濕天氣增多，導(dǎo)致甘薯黑斑病的迅速發(fā)生，對(duì)甘薯的產(chǎn)量和質(zhì)量造成了嚴(yán)重影響。化學(xué)防治可在一定程度上減輕該病害的發(fā)生，但是由于化學(xué)藥劑的施用容易導(dǎo)致農(nóng)作物抗藥性的產(chǎn)生，且對(duì)環(huán)境產(chǎn)生污染，對(duì)農(nóng)作物造成農(nóng)藥殘留嚴(yán)重危害人們的健康，因此，急需對(duì)甘薯黑斑病安全有效的防控方法。將解淀粉芽孢桿菌應(yīng)用于甘薯黑斑病生物防控，目前在我國(guó)尚未見相關(guān)報(bào)道，本文首次將生防菌應(yīng)用到甘薯黑斑病防治研究中，并通過試驗(yàn)證明該解淀粉芽孢桿菌對(duì)儲(chǔ)藏期甘薯黑斑病具有很好的生防效果，是一株具有較好應(yīng)用前景的生防菌株。

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