段學(xué)藝，高秀兵，曹 雨，趙華富，張 圓，何 萍，胡華健(貴州省茶葉研究所，貴州 貴陽 550006)

【研究意義】咖啡堿(1，3，7-三甲基黃嘌呤)是茶葉中嘌呤堿的主體成分[1]，約占茶葉干物質(zhì)的2 %～5 %[2]。茶葉咖啡堿具有興奮中樞神經(jīng)，改良心臟機(jī)能，提神、醒腦，提高思維效率，增強(qiáng)肝代謝功能等作用，同時(shí)還有利尿、分解脂肪的功效[3-6]。但是過量攝入咖啡堿，會(huì)導(dǎo)致高血壓、心率不齊[7-8]，引起鈣流失、骨質(zhì)疏松[9-10]和流產(chǎn)[11-12]等不良反應(yīng)。鑒于茶葉消費(fèi)的廣泛性和咖啡堿藥理作用的復(fù)雜性，GB 2760-2014規(guī)定可樂飲料中咖啡堿最高限量≤150 mg/kg[13]，美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)規(guī)定可樂等飲料中咖啡堿≤200 mg/mL[14]。因此，選育低咖啡堿茶樹新品種具有重要的現(xiàn)實(shí)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自20世紀(jì)80年代開始，國內(nèi)外一直在進(jìn)行茶葉脫除咖啡堿的研究工作，主要有萃取法、超臨界CO2提取、熱水浸提法和色譜吸附法等方法[15-18]。但是有關(guān)脫除茶葉咖啡堿的系統(tǒng)研究和有效方法較少?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】要從根本上降低茶葉咖啡堿，還是要從茶樹育種和栽培學(xué)等研究途徑著手，通過常規(guī)的茶樹育種方法篩選低咖啡堿茶樹新品種[19-22]。【擬解決的關(guān)鍵問題】選取貴州3種古茶樹資源與16個(gè)選育茶樹品種，提取茶樹嫩葉的咖啡堿合成酶[23]；體外進(jìn)行咖啡堿合成的酶促反應(yīng)[24]，HPLC測(cè)定反應(yīng)后各體系咖啡堿的含量[25]，比較19份茶樹資源的咖啡堿合成酶(TCS)活性，以篩選出咖啡堿合成酶活性低的茶樹資源，為選育低咖啡堿茶樹新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 茶樹資源

19份茶樹資源分別為龍井長(zhǎng)葉、龍井、保靖黃金茶、烏牛早、丹桂、盤縣大茶樹、浙農(nóng)、黃金葉、福鼎大白茶、黔湄601、黃金芽、七舍大茶樹、金觀音、鐵觀音、中茶108、晴隆大茶樹、香山早、安吉白茶和梅占，其嫩葉均采摘自貴州省茶葉研究所的種質(zhì)資源圃。

1.2 咖啡堿合成酶的提取

將新鮮茶樹嫩葉剪成小片，并立即放入-20 ℃冰箱冷凍1 h。將冷凍嫩葉樣品2 g、聚乙烯吡咯烷酮1.2 g、石英砂0.6 g、100 mmol/L磷酸鉀鹽緩沖液(pH 7.3，含有5 mmol/L巰基乙醇，5 mmol/L EDTA，0.5 %抗壞血酸鈉)10 mL一起加入已冷凍的研缽中進(jìn)行勻漿。勻漿經(jīng)4層紗布過濾后離心(重力加速度為10 000 g，下同)20 min收集上清液，加入固體硫酸銨將上清液調(diào)至20 %(W/V)的飽和度，攪拌20 min后離心15 min繼續(xù)收集上層清液，再加入固體硫酸銨將上清液調(diào)至60 %(W/V)的飽和度，攪拌20 min后離心15 min棄上清液，將沉淀溶于上述磷酸鹽緩沖液中。最后將獲得的蛋白溶液進(jìn)行凝膠層析(葡聚糖凝膠G-25，層析柱規(guī)格為30 cm×2 cm)，洗脫劑為10 mmol/L磷酸鉀鹽緩沖液(pH 7.3，含有10 mmol/L巰基乙醇，2 mmol/L EDTA)。以上所有步驟均在4 ℃條件下進(jìn)行。收集到的活性成分即為咖啡堿合成酶粗酶液，各取最先洗脫出的粗酶液1.5 mL，-20 ℃保存?zhèn)溆茫话阍?周內(nèi)酶活力下降不顯著。

1.3 咖啡堿合成酶的體外酶促反應(yīng)及活性檢測(cè)

取400 μl咖啡堿合成酶粗酶液進(jìn)行體外酶促反應(yīng)，反應(yīng)體系：咖啡堿合成酶粗酶液400 μl，1 μmol底物可可堿(theobromine)200 μl，1 μmol甲基供體S-腺苷蛋氨酸(S-adenosy-lL-metionine)50 μl。37 ℃反應(yīng)30 min后加入100 μl濃度為6 mol的HCl終止反應(yīng)。

高效液相檢測(cè)，色譜柱為Syncronis C18(4.6 mm×250 mm，5 μmol)；流動(dòng)相為乙腈-水，等度洗脫，洗脫比例為12︰88，檢測(cè)波長(zhǎng)272 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量均為20 μl。

反應(yīng)產(chǎn)物用HPLC法進(jìn)行檢測(cè)，取配制濃度為14.12 μg/mL的咖啡堿對(duì)照品溶液1、0.5、0.1 μl，進(jìn)行高效液相檢測(cè)，制作咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行定量。稱取咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(批號(hào)：A20N6L6274，含量≥99 %)3.53 mg放入5 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容作為儲(chǔ)備液，再取0.5 mL儲(chǔ)備液置于25 mL容量瓶，用甲醇定容，得到14.12 μg/mL 咖啡堿對(duì)照品溶液。

圖1 咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of caffeine

2 結(jié)果與分析

2.1 咖啡堿標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖1看出，咖啡堿進(jìn)樣質(zhì)量(x)與峰面積(y)的線性方程為y=3621.8x+1.8672，R2=1，表明其線性關(guān)系良好。

2.2 19份茶樹資源嫩葉中咖啡堿的含量

從表1看出，七舍大茶樹在體外酶促反應(yīng)終止后咖啡堿含量最高，為0.900 μg/mL；其次是保靖黃金茶，為0.376 μg/mL；第三是黃金葉，為0.210 μg/mL；烏牛早、晴隆大茶樹、龍井茶葉等15份茶樹資源的咖啡堿含量為0.101～0.164 μg/mL，差異不明顯；最低是盤縣大茶樹，為0.089 μg/mL。

2.3 19份茶樹資源嫩葉中咖啡堿合成酶的活性

從表2看出，七舍大茶樹嫩葉的咖啡堿合成酶活性最高，為0.386 U/mL；其次是保靖黃金茶，為0.161 U/mL；黃金葉、烏牛早分別為0.090和0.070 U/mL；晴隆大茶樹、龍井長(zhǎng)葉、浙濃為0.043～0.067 U/mL，差異較?。槐P縣大茶樹最低，僅0.038 U/mL。

3 討 論

茶葉中咖啡堿的含量與茶樹種質(zhì)資源特性有關(guān)，同時(shí)也與所處的自然環(huán)境和自身生長(zhǎng)期有關(guān)。不同品種茶葉中咖啡堿的含量差異很大；同一茶樹鮮葉中咖啡堿的合成較多，也是整個(gè)茶葉咖啡堿的主要來源。目前，關(guān)于不同氣候?qū)Σ枞~咖啡堿合成酶活性影響的研究較少，缺乏低咖啡堿茶樹資源適生分布區(qū)的調(diào)研，阻礙了低咖啡堿茶樹品種選育的進(jìn)程。

表1 茶樹資源嫩葉中咖啡堿合成酶體外酶促反應(yīng)終止后HPLC檢測(cè)結(jié)果Table 1 Caffeine content in tender leaves of 19 tea germplasm resources detected by HPLC after in-vitro enzymatic reaction end of caffeine synthase

表2 茶樹資源嫩葉中咖啡堿合成酶的酶活Table 2 Caffeine synthase activity in tender leaves of 19 tea germplasm resources

如何有效降低茶葉中咖啡堿含量一直是茶葉研究的熱點(diǎn)。目前，多采用理化方法在茶葉加工階段進(jìn)行咖啡堿的萃取、吸附、浸提等。雖然理化方法應(yīng)用較早，但不能解決根本問題，且成本較高，不能有效保留茶葉中的香氣和滋味。利用基因工程對(duì)茶樹資源進(jìn)行改造，沉默咖啡堿合成酶中關(guān)鍵酶的基因，即抑制咖啡堿合成酶以及S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶基因的表達(dá)，可降低茶葉中咖啡堿的含量。但是該法過程復(fù)雜、操作難度高，經(jīng)濟(jì)投入大，且降低咖啡堿的效果也不太理想。常規(guī)的茶樹育種或雜交方法篩選低咖啡堿茶樹新品種能有效降低茶葉的咖啡堿，是從本質(zhì)上降低咖啡堿的方法。但是該法選育低咖啡堿茶樹品種至少需要20 a左右，要耗費(fèi)大量的人力、物力和財(cái)力，且選育出的茶樹品種往往存在綜合性狀不良的缺點(diǎn)。通過收集低咖啡堿茶樹種質(zhì)資源，發(fā)掘品質(zhì)優(yōu)良的茶樹資源，再利用基因工程改造技術(shù)縮短茶樹品種選育時(shí)間，高效率達(dá)到茶葉品質(zhì)優(yōu)良與低咖啡堿的目的。

在龍井長(zhǎng)葉、龍井、保靖黃金茶等19份茶樹資源中，采自貴州的3份大茶樹資源(七舍大茶樹、晴隆大茶樹、盤縣大茶樹)鮮葉的咖啡堿合成酶活性差異較大，可能主要與各茶樹的種質(zhì)資源特異性有關(guān)，或與各自所處的氣候環(huán)境息息相關(guān)；其余常見16份茶樹品種鮮葉的咖啡堿合成酶活性差異不大，在0.05 U/mL左右。

4 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，在龍井長(zhǎng)葉、龍井、保靖黃金茶等19份茶樹資源中，龍井長(zhǎng)葉等其余15種的活性差異不大，在0.043～0.07 U/mL；七舍古茶的咖啡堿合成酶活性最高，為0.386 U/mL；其次是保靖黃金茶、黃金葉，分別為0.161和0.090 U/mL；盤縣古茶的咖啡堿合成酶活性最低，為0.038 U/mL。因此，盤縣古茶樹可作為低咖啡堿新品種的選育材料。

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