楊 可，呂世明*，譚艾娟，劉金平，寇 宏，王 想，張順然

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025；2. 貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550025)

抗菌藥的廣泛使用，導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性水平不斷增加[1]，使動(dòng)物細(xì)菌感染的控制難度加大，養(yǎng)殖風(fēng)險(xiǎn)和成本增高，危害養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展[2]。同時(shí)，動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性可通過(guò)食物、飲水和接觸等方式傳遞給人，危及人的健康[3]。如何控制耐藥病原菌及其危害是擺在人類面前一個(gè)重大的公共衛(wèi)生安全問(wèn)題[4]。目前能有效降低細(xì)菌耐藥性的措施仍舊十分匱乏，歐美一些國(guó)家采取優(yōu)化用藥方案[5]、限用乃至禁用抗菌藥[6]等方法來(lái)減低耐藥性，但效果不甚理想[7]。β-內(nèi)酰胺類是目前人醫(yī)和獸醫(yī)臨床最常用的一類抗生素[8]。2017年耐β-內(nèi)酰胺類腸桿菌科細(xì)菌被WHO列入首份“用于指導(dǎo)新型抗生素研究和開(kāi)發(fā)的全球抗生素耐藥重點(diǎn)病原體名單”中[9]。尋求如何對(duì)抗耐β-內(nèi)酰胺類抗生素的病原體已成為國(guó)際研究的熱點(diǎn)[10]。本研究通過(guò)創(chuàng)建耐藥菌-敏感菌，耐藥菌-敏感菌-益生菌等二元和三元微生物群落[11]，考察耐藥菌起始比例、益生菌種類和營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)耐氨芐西林大腸桿菌在群落中比例變化的影響，以期為了解耐藥菌生存競(jìng)爭(zhēng)能力[12]、制定科學(xué)合理的降低和消除動(dòng)物源耐藥性措施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株 豬源耐藥大腸桿菌G414(氨芐西林MIC>512 μg/mL)由貴州大學(xué)動(dòng)物藥理實(shí)驗(yàn)室保藏；大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922(批號(hào)A0246B)購(gòu)自廣東環(huán)凱生物科技有限公司；蠟樣芽孢桿菌CICC21252、凝結(jié)芽孢桿菌CICC20138、枯草芽孢桿菌CICC20683、地衣芽孢桿菌CICC20684購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.2 藥品 氨芐西林鈉(批號(hào)N0521A)購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司；伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB，批號(hào)20160909)、LB肉湯(批號(hào)20161107)、米勒海頓瓊脂(MHA，批號(hào)20160603)、干粉培養(yǎng)基由青島海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.3 主要儀器 SW-CT-1F超凈工作臺(tái)：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；FA2004電子分析天平：上海良平儀器儀表有限公司；XH-C快速混勻器SK-1：常州澳華儀器有限公司；HH.B11-420-S-Ⅱ型恒溫培養(yǎng)箱：上海賀德實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SHZ-82氣浴恒溫振蕩器：常州澳華儀器有限公司；LDZM-60KCS型全自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 耐藥菌比例的測(cè)定方法 參照影印培養(yǎng)法[13- 14]改良測(cè)定群落中耐藥大腸桿菌菌株的菌落數(shù)，耐藥菌氨芐西林的篩選濃度為512 μg/mL，耐藥菌落比例計(jì)算公式如下：耐藥菌落比例(%)=氨芐西林MHA培養(yǎng)基上菌落數(shù)/EMB瓊脂培養(yǎng)基上菌落數(shù)×100%。

1.4.2 耐藥大腸桿菌初始比例對(duì)耐藥菌比例的影響 0.5麥?zhǔn)隙饶退幋竽c桿菌按照0、10%、33.3%的比例(V/V)加入到0.5麥?zhǔn)隙鹊臉?biāo)準(zhǔn)大腸桿菌菌液中，37 ℃，培養(yǎng)7 d，每天離心，更換新培養(yǎng)基，并測(cè)定耐藥菌比例。

1.4.3 益生菌種類對(duì)耐藥菌比例的影響 蠟樣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等3種益生菌菌液制成0.5麥?zhǔn)隙?，分別與含10%耐藥大腸桿菌的0.5麥?zhǔn)隙葮?biāo)準(zhǔn)大腸桿菌菌液等體積混合，按1.4.1項(xiàng)方法測(cè)定1～7 d的耐藥菌比例。

1.4.4 營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)耐藥菌比例的影響 將含10%耐藥大腸桿菌的0.5麥?zhǔn)隙葮?biāo)準(zhǔn)大腸桿菌菌液接種至相應(yīng)濃度的LB肉湯，按1%低營(yíng)養(yǎng)水平、10%中營(yíng)養(yǎng)水平、100%高營(yíng)養(yǎng)水平考察益生菌初始比例對(duì)耐藥菌比例的影響。

以上試驗(yàn)組均置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中(37 ℃、200 r/min)培養(yǎng)，每隔1 d取出測(cè)量一次耐藥菌比例并做更換培養(yǎng)液等處理，連續(xù)測(cè)量7 d。

1.5 數(shù)據(jù)處理 利用SPSS 22.0軟件對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 起始比例對(duì)群落中耐藥菌比例的影響 結(jié)果如圖1所示。圖1顯示，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，2種耐藥菌起始比例群落中的耐藥菌比例在1～7 d均逐漸上升；高初始比例組的耐藥菌比例從33%上升至64%，絕對(duì)值增加31%，超過(guò)敏感菌成為群落中的優(yōu)勢(shì)菌，并且1～7 d的比例均高于10%組。低初始比例組第1天從10%快速上升至36%，第7天升至43%，絕對(duì)值增加33%，升高幅度極顯著大于高比例組(P<0.01)。33%組對(duì)數(shù)趨勢(shì)線方程(y=0.1347ln(x)+0.3306)和10%組對(duì)數(shù)趨勢(shì)線方程(y=0.1318ln(x)+0.1661)斜率差異不顯著(P>0.05)，10%組對(duì)數(shù)趨勢(shì)線方程的截距0.1661極顯著地高于折線起始點(diǎn)0.1(P<0.01)。說(shuō)明無(wú)論初始比例是高還是低，耐藥菌都沒(méi)有因攜帶耐藥基因而升高其生存適應(yīng)度代價(jià)，反而獲得某種競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，使其逐步成為群落中的優(yōu)勢(shì)菌；低起始比例有助于耐藥菌初期的快速生長(zhǎng)，并可獲得比高起始比例組更高的絕對(duì)增長(zhǎng)率。

圖1 起始比例對(duì)耐藥菌比例的影響Fig 1 Influence of initial ratios on the proportion of amp-resistant E.coli

2.2 益生菌種類對(duì)耐藥菌比例的影響 結(jié)果如圖2所示。與對(duì)照組相比較，枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌在第1～7天能夠顯著降低耐藥大腸桿菌在群落中比例的升高趨勢(shì)(P<0.05)。蠟樣芽孢桿菌組中耐藥菌比例在第1天能夠降低耐藥大腸桿菌在群落中比例的升高趨勢(shì)，而第2天從21%陡然上升至43%，上升比例極顯著地大于對(duì)照組(P<0.01)，隨后又大幅滑落，第五天回落到10%附近，最終降至第7天的5%，與對(duì)照組比較差異極顯著(P<0.01)。對(duì)照組對(duì)數(shù)趨勢(shì)線方程(y=0.1278ln(x)+0.1648)、枯草芽孢桿菌組對(duì)數(shù)趨勢(shì)線方程(y=0.1257ln(x)+0.0883)、地衣芽孢桿菌對(duì)數(shù)趨勢(shì)線方程(y=0.113ln(x)+0.1019)三者斜率差異不顯著(P>0.05)，截距差異極顯著(P<0.01)。蠟樣芽孢桿菌對(duì)數(shù)趨勢(shì)線方程(y=-0.036ln(x)+0.2352)的斜率與其他三組相比差異極顯著(P<0.01)。說(shuō)明枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌只能降低耐藥菌比例在各天的上升趨勢(shì)且效果相近，而蠟樣芽孢桿菌則具有降低耐藥菌的競(jìng)爭(zhēng)適應(yīng)度、促使其消亡的能力。

圖2 益生菌種類對(duì)耐藥菌比例的影響Fig 2 Influence of added probiotics on the proportion of amp-resistant E.coli

2.3 營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)耐藥菌比例的影響 結(jié)果如圖3所示。圖3顯示，高、中、低營(yíng)養(yǎng)條件下，1～7 d群落中耐藥菌比例均逐步升高；三組的對(duì)數(shù)趨勢(shì)線方程分別為y=0.1422ln(x)+0.1802(10%組)、y=0.1318ln(x)+0.1661(100%)、y=0.1125ln(x)+0.1159(1%組)，1%組(低營(yíng)養(yǎng)水平)的耐藥菌比例較其他兩組上升最慢，10%組(中營(yíng)養(yǎng)水平)的上升最快，而100%組(高營(yíng)養(yǎng)水平)的上升速度介于二者之間，三者的差異顯著(P<0.05)。說(shuō)明耐藥菌株在一個(gè)中等營(yíng)養(yǎng)水平環(huán)境中的相對(duì)適應(yīng)度最大。

3 討論與小結(jié)

3.1 耐氨芐西林大腸桿菌G414與標(biāo)準(zhǔn)菌株競(jìng)爭(zhēng)力比較 細(xì)菌種內(nèi)和種間的競(jìng)爭(zhēng)是塑造試管中群落結(jié)構(gòu)的重要生態(tài)過(guò)程，它與個(gè)體生長(zhǎng)速率、繁殖率、存活率等有關(guān)[15]。經(jīng)典的進(jìn)化論認(rèn)為，當(dāng)細(xì)菌在抗菌藥選擇壓力下耐藥突變菌株數(shù)量增加，獲得了在有藥環(huán)境下的生存優(yōu)勢(shì)，而成為該環(huán)境下的優(yōu)勢(shì)菌群；在無(wú)藥環(huán)境下，耐藥菌株攜帶和表達(dá)耐藥基因需要額外耗費(fèi)細(xì)菌的資源，增加了細(xì)菌的競(jìng)爭(zhēng)適應(yīng)度代價(jià)(生存負(fù)擔(dān))，降低其競(jìng)爭(zhēng)適應(yīng)度，而在與野生型細(xì)菌的競(jìng)爭(zhēng)中處于劣勢(shì)，最終被稀釋，消失。很多的研究結(jié)果也證明了這個(gè)理論的正確性。但研究結(jié)果表明，除蠟樣芽孢桿菌外，其他單因素水平作用下耐藥菌株的生存競(jìng)爭(zhēng)能力均強(qiáng)于標(biāo)準(zhǔn)菌株，說(shuō)明本株耐氨芐西林大腸桿菌由于耐藥突變而獲得了比野生菌更強(qiáng)的生存能力，此結(jié)果與傳統(tǒng)的關(guān)于耐藥菌在無(wú)藥環(huán)境中競(jìng)爭(zhēng)適應(yīng)度下降的理論相左。此結(jié)果與Melny[16]、Andersson[17]等報(bào)道的結(jié)果相似。

圖3 營(yíng)養(yǎng)水平對(duì)耐藥菌比例的影響Fig 3 Influence of nutritional levels on the proportion of amp-resistant E.coli

3.2 益生芽孢桿菌對(duì)耐氨芐西林大腸桿菌G414生存競(jìng)爭(zhēng)的影響 在狹小的試管中菌群間存在著營(yíng)養(yǎng)和生存空間等資源的競(jìng)爭(zhēng)作用，由于自然微生物群落成份過(guò)于復(fù)雜，作用機(jī)制難以弄清，可控性差，因此，人工創(chuàng)建的兩個(gè)或多個(gè)物種共培養(yǎng)的微生物群落，利用微生物生態(tài)學(xué)方法，便于考察耐藥大腸桿菌群落組成、功能和互作效應(yīng)[18]。本研究考察了大腸桿菌耐藥和標(biāo)準(zhǔn)株型之間、大腸桿菌和芽孢桿菌不同種屬之間的生存競(jìng)爭(zhēng)。研究表明所用的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌能微弱地降低耐藥菌株的生存競(jìng)爭(zhēng)能力，而蠟樣芽孢桿菌除第2天外均極顯著地抑制耐藥菌株的生長(zhǎng)。這在國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。若加以進(jìn)一步地研究開(kāi)發(fā)，用于養(yǎng)殖場(chǎng)等耐藥菌密度加大的區(qū)域，可能會(huì)在一定程度上減小環(huán)境中耐藥菌的比例。

3.3 耐氨芐西林大腸桿菌G414及使用氨芐西林的安全性 營(yíng)養(yǎng)匱乏會(huì)增加物種間的生存競(jìng)爭(zhēng)壓力，加速生存淘汰。本研究表明耐藥菌在高中低的營(yíng)養(yǎng)條件下均表現(xiàn)出比敏感菌更強(qiáng)的生存競(jìng)爭(zhēng)能力。此結(jié)果與Phan[19]等報(bào)道的結(jié)果相似。說(shuō)明該耐藥菌可能獲得的突變機(jī)制不僅沒(méi)有增加其競(jìng)爭(zhēng)適應(yīng)度代價(jià)，反而降低了其競(jìng)爭(zhēng)適應(yīng)度代價(jià)，使其在惡劣環(huán)境中獲得更強(qiáng)的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。以此推測(cè)，此耐藥菌在環(huán)境中有遠(yuǎn)高于敏感菌的生存競(jìng)爭(zhēng)能力，很容易成為優(yōu)勢(shì)菌群。因此，通過(guò)停止使用藥物是不能恢復(fù)耐藥區(qū)域內(nèi)細(xì)菌對(duì)相應(yīng)藥物的敏感性，這將對(duì)安全用藥和人的健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。應(yīng)該從耐藥的角度來(lái)重新評(píng)估氨芐西林的使用安全性。

研究采用人工創(chuàng)建的多個(gè)物種共培養(yǎng)的微生物群落來(lái)呈現(xiàn)耐氨芐西林大腸桿菌在其中的比例變化，不同于目前國(guó)內(nèi)外通行的以純培養(yǎng)微生物為對(duì)象的耐藥性研究。在后續(xù)的研究中有必要介入一些前沿的技術(shù)手段進(jìn)行微生物組方面的探索，例如用轉(zhuǎn)錄組從基因的表達(dá)水平研究大腸桿菌群落耐藥基因動(dòng)態(tài)表達(dá)和調(diào)控；用蛋白質(zhì)組揭示群落中蛋白質(zhì)的組成、豐度、相互關(guān)系，等等。把這些分析結(jié)果結(jié)合起來(lái)，推測(cè)其潛在的作用機(jī)制。此外，還可以構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，預(yù)測(cè)和描述耐藥菌株和其他細(xì)菌的生長(zhǎng)、互作，以便于理解其群落屬性變化的基本原則，為群體水平的耐藥性研究建立基礎(chǔ)。相信從個(gè)體水平拓展到群落水平是未來(lái)微生物耐藥性研究發(fā)展的一個(gè)趨勢(shì)。

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