李萬(wàn)義， 孔 鑫， 韓亞潔， 宋 紅

(東北林業(yè)大學(xué)園林學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040)

桃葉衛(wèi)矛(Euonymusbungeanus)，別稱白杜、絲綿木，是衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬的一種落葉小喬木，是我國(guó)常見的觀賞類庭園樹種之一。桃葉衛(wèi)矛葉形秀麗，植株繁茂，包被有紅色假種皮的果實(shí)可長(zhǎng)期宿存于枝頭，到了冬季，白雪紅果相映，十分美麗，在冬季可為季相色彩單調(diào)的北方園林增添了不少色彩。近年來(lái)，許多研究人員從多方面對(duì)桃葉衛(wèi)矛進(jìn)行了研究：溫陽(yáng)等通過(guò)對(duì)8個(gè)鄉(xiāng)土樹種抗逆性的對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，桃葉衛(wèi)矛在耐寒、抗旱、抗風(fēng)等方面具有良好的適應(yīng)性[1]；劉繼陽(yáng)等通過(guò)對(duì)桃葉衛(wèi)矛果實(shí)中主要活性成分的提取并對(duì)這些成分進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，桃葉衛(wèi)矛果實(shí)總皂苷對(duì)人肝癌細(xì)胞系SMMC、人宮頸癌細(xì)胞系HeLa和乳腺癌細(xì)胞系MCF7有明顯的抑制生長(zhǎng)作用[2]；宋紅等通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，桃葉衛(wèi)矛種子粗脂肪中含有棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸等脂肪酸[3]；還有研究發(fā)現(xiàn)，桃葉衛(wèi)矛木材細(xì)膩堅(jiān)韌，可用于雕刻、制作帆桿或滑車等，其種子可作藥用，用于治療膝關(guān)節(jié)痛、漆瘡等疾病[4]。由此可見，桃葉衛(wèi)矛是一種集工業(yè)、藥用、觀賞應(yīng)用于一身的植物，具有較高的推廣價(jià)值。隨著近年來(lái)各種極端氣候的出現(xiàn)以及人為因素對(duì)生態(tài)環(huán)境的破壞，如何對(duì)桃葉衛(wèi)矛的種質(zhì)資源進(jìn)行妥善保存是今后的研究方向。若采用傳統(tǒng)的保存方法，如就地保存、遷地保存等， 極易使種質(zhì)資源受到病菌或蟲害的影響，

進(jìn)而給種質(zhì)資源的保護(hù)造成極大障礙，因此，尋求一條經(jīng)濟(jì)、高效、便捷的種質(zhì)資源保存途徑迫在眉睫。

植物種質(zhì)資源超低溫保存是指將植物細(xì)胞、組織或器官在液氮(-196 ℃)的超低溫條件下進(jìn)行保存，在如此低的溫度下，植物材料中參與新陳代謝的各種生物酶的活性受到極大抑制，生物體新陳代謝基本停止，處于“假死”狀態(tài)，利用該方法可以實(shí)現(xiàn)植物種質(zhì)資源的永久保存[5]。目前已經(jīng)成功進(jìn)行超低溫保存的材料類型有種子、休眠芽、莖尖分生組織、花粉、合子胚(胚軸)、體細(xì)胞胚、懸浮細(xì)胞、愈傷組織、原生質(zhì)體等[6]。其中花粉超低溫保存操作簡(jiǎn)單，可保持特定的基因型，解決雜交育種時(shí)的花期不遇或地理隔離等問(wèn)題，也可有效解決每年采集花粉時(shí)擔(dān)心與其他品系花粉混合的問(wèn)題。因此，本試驗(yàn)將對(duì)桃葉衛(wèi)矛的花粉進(jìn)行超低溫保存，通過(guò)對(duì)花粉最適萌發(fā)培養(yǎng)基配比、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時(shí)間、超低溫保存最適含水量以及超低溫保存后的化凍方式進(jìn)行探究，以期為今后桃葉衛(wèi)矛種質(zhì)資源保存及其新品種培育的深入研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)地點(diǎn)設(shè)在適宜桃葉衛(wèi)矛生長(zhǎng)的黑龍江省哈爾濱市東北林業(yè)大學(xué)校園內(nèi)。哈爾濱市的氣候?qū)僦袦貛Т箨懶约撅L(fēng)氣候，冬長(zhǎng)夏短，全年平均降水量為569.1 mm，降水主要集中在6—9月份，夏季占全年降水量的60%，集中降雪期為每年11月至次年1月。四季分明，冬季1月平均氣溫約為 -19 ℃，夏季7月的平均氣溫約為23 ℃[7]。桃葉衛(wèi)矛為聚傘花序腋生，每個(gè)花序有3～15朵花，花兩性，為黃綠色，花期為5月下旬至6月[8]。本試驗(yàn)從2015年6月開始，選擇晴朗天氣，從生長(zhǎng)發(fā)育良好的桃葉衛(wèi)矛母樹上用鑷子采集新鮮花粉，采集完畢后裝入硫酸紙袋后拿回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花粉生活力測(cè)定方法 花粉生活力是衡量花粉健康與否的重要指標(biāo)，目前對(duì)于花粉生活力的表述有生活力(viability)、可染性(stainability)、花粉質(zhì)量(pollen quality)、活力(vigour)、萌發(fā)力(germinability)、可育性(fertility)、受精力(fertilization ability)[9]。根據(jù)前人的研究進(jìn)展以及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果分析，本試驗(yàn)選用可染性和萌發(fā)力2項(xiàng)指標(biāo)?？扇拘缘臏y(cè)定采用氯化三苯基四氮唑(簡(jiǎn)稱TTC)染色法，參照韓成剛等對(duì)芍藥花粉生活力的測(cè)定方法[10]，將一定量的0.5% TTC溶液注入1塊凹載片的凹穴中(液面不超過(guò)凹穴的最大深度)，用解剖針將花粉均勻地撒在溶液上面。將該凹載片放置在鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，然后將其放入25 ℃人工氣候箱中進(jìn)行黑暗培養(yǎng)，6 h后取出凹載片，放在電子顯微鏡下觀察花粉染色情況，選取3個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)被染色花粉占視野內(nèi)全部花粉總數(shù)的比例。萌發(fā)力的測(cè)定采用懸滴萌發(fā)法[11]，首先將1滴花粉萌發(fā)培養(yǎng)液(少于200 μL)滴在方形蓋玻片上，然后將桃葉衛(wèi)矛花粉用解剖針均勻地撒在培養(yǎng)液上，再將蓋玻片反轉(zhuǎn)放置在凹載片上，使花粉懸浮于培養(yǎng)液上，如圖1所示。將凹載片緩緩放入鋪有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，防止由于轉(zhuǎn)移過(guò)程中產(chǎn)生的搖晃使得培養(yǎng)液與凹載片接觸。將培養(yǎng)皿放入 25 ℃ 人工氣候箱中培養(yǎng)一段時(shí)間后，將凹載片取出，放置在電子顯微鏡下觀察并統(tǒng)計(jì)萌發(fā)的花粉數(shù)?；ǚ酃荛L(zhǎng)度超過(guò)花粉直徑即為萌發(fā)花粉。每次隨機(jī)選取3個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)視野內(nèi)萌發(fā)花粉數(shù)占花粉總數(shù)的百分比，最后取平均值，作為該花粉的萌發(fā)率。

1.2.2 花粉萌發(fā)最適培養(yǎng)液的選擇 以桃葉衛(wèi)矛花粉為材料，以去離子水作為溶劑，加入不同濃度的蔗糖、硼酸，采用2因素完全隨機(jī)的方法，共設(shè)計(jì)16種不同培養(yǎng)基(表1)。在培養(yǎng)液上均勻地撒播桃葉衛(wèi)矛花粉，然后將其放置在25 ℃人工氣候箱中光照培養(yǎng)一段時(shí)間后觀察花粉萌發(fā)狀況，根據(jù)花粉的萌發(fā)率確定桃葉衛(wèi)矛花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)液。

表1 因素水平設(shè)計(jì)

1.2.3 不同培養(yǎng)時(shí)間及培養(yǎng)環(huán)境對(duì)花粉萌發(fā)率的影響 以桃葉衛(wèi)矛花粉為材料，將其均勻地撒播在篩選出的最適培養(yǎng)液上，然后分成2組，置于室溫條件下，1組放在光照下培養(yǎng)，另1組放于暗處培養(yǎng)，培養(yǎng)0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h后，觀察并記錄花粉萌發(fā)狀況。

1.2.4 花粉日活力的變化 從桃葉衛(wèi)矛開花的一天中選定不同的時(shí)段，即06：00、08：00、10：00、12：00、14：00、16：00、18：00，每隔2 h測(cè)1次花粉活力 (萌發(fā)率)，觀察一天中花粉活力的日變化。

1.2.5 超低溫保存后不同化凍方式對(duì)桃葉衛(wèi)矛花粉萌發(fā)率的影響 將新鮮花粉裝入1.8 mL冷凍管中，花粉含量不超過(guò)冷凍管最大體積的2/3。投入液氮罐中至少保存1 h以上后取出，采用以下3種不同的化凍方式進(jìn)行解凍：(1)室溫化凍30 min；(2)40 ℃水浴化凍2 min；(3)自來(lái)水化凍8 min?；瘍鐾戤吅髮?duì)花粉的生活力進(jìn)行測(cè)定，比較花粉的萌發(fā)率，選出最適化凍方式。

1.2.6 桃葉衛(wèi)矛花粉超低溫保存 (1)不同含水量花粉的制備。首先采用烘干法測(cè)得桃葉衛(wèi)矛花粉的最大含水量，具體方法如下：將稱量瓶放入烘箱中，將溫度調(diào)至105 ℃，烘至恒質(zhì)量，稱量得數(shù)據(jù)ma，放入花粉再稱量，得數(shù)據(jù)mb(即樣品烘干前鮮質(zhì)量)；然后放入烘箱內(nèi)，在5～10 min內(nèi)將溫度調(diào)至105 ℃，開始計(jì)時(shí)，于105 ℃ 2 h烘干后取出瓶蓋封口，放入干燥器，冷卻20～30 min，取出稱質(zhì)量，然后再敞開瓶蓋，在105 ℃條件下烘烤40～60 min，反復(fù)2～3次，直到質(zhì)量恒定，得數(shù)據(jù)mc，即樣品烘后干質(zhì)量，以鮮質(zhì)量為基數(shù)，根據(jù)如下公式計(jì)算花粉含水量：

(1)

在得到桃葉衛(wèi)矛花粉最大含水量ω1后，利用硅膠干燥法進(jìn)行花粉不同含水量梯度的配制。具體方法如下：稱取一定量的新鮮花粉ma，放入1.8 mL冷凍管中，然后稱取二者總質(zhì)量mb，再然后將裝有花粉的冷凍管放入硅膠干燥器中，干燥一定時(shí)間后取出冷凍管，稱取其質(zhì)量mc，根據(jù)公式(2)計(jì)算出該段時(shí)間損失的含水量ω2，最終測(cè)得干燥一定時(shí)間后的花粉含水量ω，以此類推進(jìn)而得到不同含水量梯度的花粉。相關(guān)公式如下：

(2)

ω=ω1-ω2。

(3)

(2)根據(jù)上述方法將花粉調(diào)制成不同含水量梯度后，將其投入液氮罐中保存一段時(shí)間后取出，化凍后測(cè)定桃葉衛(wèi)矛花粉的萌發(fā)率。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 20.0和Excel軟件對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Excel對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)畫圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 桃葉衛(wèi)矛花粉染色法的結(jié)果分析

經(jīng)過(guò)TTC染色后，在顯微鏡下沒有觀察到被染成紅色的花粉粒，可見該方法不適合用于桃葉衛(wèi)矛花粉活力的測(cè)定。這與楊秀蓮等研究桂花花粉活力時(shí)得出的研究結(jié)果一致[12]，因此本研究中桃葉衛(wèi)矛花粉活力的測(cè)定選用離體懸滴萌發(fā)法。

2.2 桃葉衛(wèi)矛花粉萌發(fā)最適培養(yǎng)液的選擇

從表2可以看出，桃葉衛(wèi)矛花粉在不同配方的培養(yǎng)液中萌發(fā)情況有差異?；ǚ墼谡崽菨舛葹?00 g/L時(shí)萌發(fā)率達(dá)到最高值。而隨著蔗糖濃度的進(jìn)一步增加，花粉的萌發(fā)率又降低。對(duì)桃葉衛(wèi)矛花粉在不同蔗糖和硼酸濃度培養(yǎng)基上的萌發(fā)率進(jìn)行方差分析，由表3可以看出，花粉的萌發(fā)率在不同的蔗糖濃度間(F=78.428，P<0.01)、硼酸濃度×蔗糖濃度間(F=23.243，P<0.01)以及不同硼酸濃度間(F=10.047，P<0.01)差異都極顯著。從兩者貢獻(xiàn)的離差平方和來(lái)看，蔗糖對(duì)花粉萌發(fā)率的影響大于硼酸對(duì)花粉萌發(fā)率的影響，即蔗糖貢獻(xiàn)的離差平方和(630.190)大于硼酸貢獻(xiàn)的離差平方和(80.733)。結(jié)合桃葉衛(wèi)矛花粉的萌發(fā)率，最終本研究篩選出桃葉衛(wèi)矛花粉培養(yǎng)液中蔗糖濃度和硼酸濃度最適配比為 100 g/L 蔗糖+150 mg/L硼酸。

2.3 不同培養(yǎng)時(shí)間及培養(yǎng)環(huán)境對(duì)桃葉衛(wèi)矛花粉萌發(fā)率的影響

從圖2可以看出，桃葉衛(wèi)矛花粉在不同培養(yǎng)環(huán)境下的萌發(fā)率有明顯的差異，其中在光照條件下萌發(fā)率最高可達(dá)10.22%，而在黑暗條件下的最高萌發(fā)率為3.5%，因此對(duì)于桃葉衛(wèi)矛花粉的培養(yǎng)應(yīng)在光照條件下進(jìn)行。進(jìn)一步通過(guò)方差分析可知，F(xiàn)=21.273，對(duì)應(yīng)的P<0.01，可以認(rèn)為6個(gè)培養(yǎng)時(shí)間中至少有1個(gè)培養(yǎng)時(shí)間與其他培養(yǎng)時(shí)間之間存在顯著差異。利用多重比較(LSD)分析可知，光照條件下0.5、1.0、1.5、2.0 h與其他培養(yǎng)時(shí)間存在顯著差異，而2.0、2.5、3.0 h之間沒有顯著差異。由圖2可知，花粉前2.0 h的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，其萌發(fā)率有逐漸升高的趨勢(shì)，而在2.0 h后該趨勢(shì)進(jìn)入較為平穩(wěn)的階段，花粉萌發(fā)率不再有明顯的變化幅度。由此推測(cè)，桃葉衛(wèi)矛花粉最佳的培養(yǎng)時(shí)間為2.0 h。在試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)， 花粉的萌發(fā)數(shù)量不再增加，但花粉管的長(zhǎng)度在不斷伸長(zhǎng)，最終會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)花粉萌發(fā)數(shù)量的統(tǒng)計(jì)，這與陳珊對(duì)亮葉蠟梅花粉進(jìn)行活力測(cè)定時(shí)通過(guò)暗培養(yǎng)24 h后進(jìn)行觀察統(tǒng)計(jì)的結(jié)果不一致[13]，推測(cè)引起該結(jié)果的原因?yàn)橹参锘蛐偷牟町悺?/p>

表2 不同蔗糖和硼酸濃度對(duì)桃葉衛(wèi)矛花粉萌發(fā)率的影響

注：數(shù)值為每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。同列數(shù)據(jù)后不同小寫、大寫字母分別表示差異顯著、極顯著。

表3 不同蔗糖和硼酸濃度下桃葉衛(wèi)矛花粉萌發(fā)率的方差分析結(jié)果

注：雙因素方差分析置信區(qū)間為95%。P<0.05表明顯著，P<0.01表明極顯著。

2.4 桃葉衛(wèi)矛花粉日活力變化的結(jié)果分析

由圖3可知，桃葉衛(wèi)矛的花粉萌發(fā)率(活力)在一天中的不同時(shí)段是不同的，其大致趨勢(shì)為06：00—12：00時(shí)段為下降趨勢(shì)，在12：00花粉活力降至最低值；而在12：00—16：00時(shí)段花粉活力呈上升趨勢(shì)，并在16：00達(dá)到最高值；在16：00—18：00時(shí)段，花粉活力逐步下降。通過(guò)方差分析可以看出，F(xiàn)=30.119，對(duì)應(yīng)的P=0.00(<0.05)，可以認(rèn)為在7個(gè)時(shí)刻中至少有1個(gè)時(shí)刻與另外1個(gè)時(shí)刻存在顯著差異。通過(guò)進(jìn)一步多重比較分析可知，12：00與16：00與其他各時(shí)刻基本存在顯著差異。因此可知，桃葉衛(wèi)矛花粉在一天中12：00時(shí)的活力最低，在16：00時(shí)的活力最高，這與李稚的研究結(jié)果一致[14]，可能是因?yàn)樘胰~衛(wèi)矛花粉在外界環(huán)境溫度較高時(shí)，花粉自身的酶活性降低，影響了其萌發(fā)力。

2.5 不同化凍方式對(duì)桃葉衛(wèi)矛花粉萌發(fā)率的影響

本試驗(yàn)采用3種化凍方式于桃葉衛(wèi)矛花粉超低溫保存24 h后進(jìn)行化凍試驗(yàn)，比較3種化凍方式對(duì)花粉萌發(fā)率的影響，最終篩選出最佳化凍方式。由圖4可知，化凍方式對(duì)保存后的桃葉衛(wèi)矛花粉萌發(fā)率有極顯著影響(F=613.430，P=0.00<0.01)，采用室溫化凍30 min后，桃葉衛(wèi)矛的花粉萌發(fā)率可達(dá)14.34%，其效果優(yōu)于40 ℃水浴化凍2 min和自來(lái)水化凍8 min這2種化凍方式。由此可以推測(cè)，室溫化凍 30 min 的化凍效果較好，可以將其運(yùn)用于下一步的桃葉衛(wèi)矛花粉超低溫保存試驗(yàn)中。

2.6 不同含水量花粉超低溫保存前后的萌發(fā)率

脫水環(huán)節(jié)對(duì)花粉的超低溫保存是至關(guān)重要的，花粉含水量越高，低溫冷藏時(shí)細(xì)胞內(nèi)越易形成冰晶，以致細(xì)胞膜受損，保存后的花粉死亡率就會(huì)越高，不能達(dá)到超低溫保存的目的。因此，探究花粉液氮保存前最適含水量對(duì)于花粉超低溫保存具有重要影響。由圖5可以看出，不同含水量的桃葉衛(wèi)矛花粉在液氮保存前的萌發(fā)率沒有顯著差異，當(dāng)花粉經(jīng)過(guò)液氮保存后，出現(xiàn)了顯著差異。當(dāng)桃葉衛(wèi)矛花粉含水量為初始狀態(tài)(14.56%)時(shí)，液氮保存后的花粉全部死亡，推測(cè)是由于花粉內(nèi)部含水量較高，在-196 ℃的超低溫環(huán)境中產(chǎn)生了冰晶，進(jìn)而破壞花粉內(nèi)部的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致花粉死亡。隨著花粉含水量的進(jìn)一步降低，在4.14%～12.32%的含水量區(qū)間內(nèi)，超低溫保存后的花粉萌發(fā)率呈現(xiàn)隨含水量降低逐步升高的趨勢(shì)。而當(dāng)花粉含水量進(jìn)一步從4.14%降低至1.67%時(shí)，超低溫保存后的花粉萌發(fā)率又開始降低，并最終全部死亡，可能是因?yàn)檫M(jìn)一步的干燥對(duì)花粉細(xì)胞內(nèi)的束縛水造成了破壞，最終使花粉死亡。這與張玉進(jìn)等的研究結(jié)果[15]一致。

3 討論

園林植物種質(zhì)資源的類型有很多，如種子、花粉、莖尖等，而評(píng)價(jià)這些種質(zhì)資源好壞的關(guān)鍵因素就是其生活力指標(biāo)。根據(jù)王欽麗等的研究結(jié)果可知，花粉生活力的測(cè)定方法目前可分為萌發(fā)測(cè)定和不萌發(fā)測(cè)定2種[9]。本研究選用了2種測(cè)定方法相結(jié)合，對(duì)桃葉衛(wèi)矛花粉的生活力進(jìn)行測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)TTC染色法染色后的花粉沒有變紅的現(xiàn)象，而經(jīng)離體萌發(fā)法測(cè)定后，桃葉衛(wèi)矛花粉的花粉管有了明顯的伸長(zhǎng)，由此可知TTC染色法不適合用來(lái)檢測(cè)桃葉衛(wèi)矛花粉的生活力。

蔗糖和硼酸對(duì)于花粉萌發(fā)具有十分重要的作用。研究表明，蔗糖在花粉萌發(fā)過(guò)程中主要有2個(gè)方面的作用：一是保持了花粉細(xì)胞與外部培養(yǎng)液之間的滲透平衡，防止花粉及花粉管由于滲透失衡而出現(xiàn)破裂；二是可以給花粉的萌發(fā)以及花粉管的伸長(zhǎng)提供能量。而硼酸在花粉萌發(fā)過(guò)程中的主要作用是促進(jìn)花粉內(nèi)部鈣離子的輸送，同時(shí)幫助花粉更大程度地吸收糖分，產(chǎn)生糖-硼酸復(fù)合體，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸以及花粉萌發(fā)起到促進(jìn)作用[16-18]。本試驗(yàn)研究了蔗糖、硼酸雙因素作用下對(duì)花粉萌發(fā)的影響，結(jié)果表明，二者對(duì)花粉萌發(fā)率的影響都呈現(xiàn)出隨著濃度的不斷升高，桃葉衛(wèi)矛花粉萌發(fā)率先升高后降低的規(guī)律。同時(shí)方差分析的結(jié)果表明，無(wú)論是蔗糖、硼酸的單因素作用，還是兩者共同作用，都對(duì)花粉的萌發(fā)起著顯著作用，說(shuō)明桃葉衛(wèi)矛花粉的萌發(fā)培養(yǎng)液需要蔗糖和硼酸。進(jìn)一步比較可知，二者共同作用時(shí)，桃葉衛(wèi)矛花粉的萌發(fā)率要優(yōu)于二者的單因素作用。最終篩選出桃葉衛(wèi)矛花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)液配方為100 g/L蔗糖+150 mg/L硼酸。

花粉的萌發(fā)主要是由內(nèi)因和外因共同決定的。內(nèi)因是指花粉自身的基因型，而外因是指環(huán)境因素。本試驗(yàn)中研究了桃葉衛(wèi)矛花粉在不同培養(yǎng)時(shí)間以及不同培養(yǎng)環(huán)境中的萌發(fā)情況。結(jié)果顯示，桃葉衛(wèi)矛花粉在光照環(huán)境下的萌發(fā)率要大于黑暗環(huán)境下的萌發(fā)率。而有的木本植物的花粉如亮葉蠟梅，需要在黑暗環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，推測(cè)其原因是由花粉自身的基因型決定的。而對(duì)于花粉的培養(yǎng)時(shí)間，不同的植物材料其花粉的培養(yǎng)時(shí)間也不同，有些植物花粉的培養(yǎng)時(shí)間需要3 h，如魔芋、山茶[15，19]，而亮葉蠟梅的花粉培養(yǎng)時(shí)間需要長(zhǎng)達(dá) 12 h[13]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，桃葉衛(wèi)矛花粉的最佳培養(yǎng)時(shí)間為 2 h，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間大于2 h后，花粉的萌發(fā)率將不再有較為明顯的變化。此外還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)會(huì)導(dǎo)致花粉管過(guò)長(zhǎng)，不利于后期統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

趙劍穎等的研究表明：一天中萬(wàn)壽菊的花粉活力呈先升高后降低的趨勢(shì)，在11：00—13：00之間花粉活力最高[20]。而在本研究中桃葉衛(wèi)矛花粉在盛花期中的某天內(nèi)的活力變化趨勢(shì)為先降低后升高，在12：00時(shí)花粉活力最低，而在16：00時(shí)花粉活力最高。這與李稚在研究桂花花粉日活力變化時(shí)的研究結(jié)果一致[14]，可能是由于夏季日最高氣溫集中在中午，過(guò)高的氣溫使得花粉內(nèi)部的酶活性降至較低的水平，從而導(dǎo)致花粉萌發(fā)率降低。綜上所述，桃葉衛(wèi)矛花粉最佳采集時(shí)期為一天中的16：00。

化凍方式是影響花粉超低溫保存效果的又一個(gè)重要的因素，如果采用了不適當(dāng)?shù)幕瘍龇绞?，有可能在化凍過(guò)程中細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生次生冰，對(duì)花粉造成二次傷害，從而影響其花粉活力。目前主要的化凍方式大致可以分為35～40 ℃水浴化凍、自來(lái)水化凍、室溫化凍。因此在本試驗(yàn)中對(duì)應(yīng)研究了桃葉衛(wèi)矛花粉超低溫保存后采用40 ℃水浴化凍2 min、自來(lái)水沖洗8 min、室溫化凍30 min 3種方式進(jìn)行化凍。結(jié)果顯示，室溫化凍30 min是超低溫保存桃葉衛(wèi)矛花粉的最佳化凍方式。目前較為廣泛的化凍方式為35～40 ℃水浴化凍，而該試驗(yàn)結(jié)果與其他植物花粉超低溫保存化凍方式有所區(qū)別[13-15，19]，因此，對(duì)于選擇何種方式進(jìn)行化凍應(yīng)根據(jù)具體植物的花粉情況來(lái)決定。

新鮮的花粉含水量一般都比較高，過(guò)高的含水量在冷凍過(guò)程中形成冰晶，導(dǎo)致細(xì)胞膜受損，最終使花粉死亡。因此許多研究表明，適宜的花粉含水量是實(shí)現(xiàn)超低溫保存的關(guān)鍵[21-23]。然而由于花粉形態(tài)的特殊性和采集的難度，如果采用傳統(tǒng)的烘干法會(huì)消耗大量的花粉[24]，因此本試驗(yàn)中采用室溫硅膠干燥法，先測(cè)出新鮮花粉的最大含水量，然后通過(guò)將花粉放入硅膠干燥器中干燥不同時(shí)間，產(chǎn)生一定的質(zhì)量差，而這個(gè)質(zhì)量差即花粉在該干燥時(shí)間內(nèi)失去的水分質(zhì)量，求出失去水分占原花粉質(zhì)量的比例，再用最大含水量減去失去水分的比例，即可求得花粉的含水量，這樣既可以得到所需的花粉含水量，又可以避免烘干法測(cè)定花粉含水量時(shí)的高溫環(huán)境使花粉喪失活性。利用該方法制備得到不同含水量梯度的桃葉衛(wèi)矛花粉后，將這些花粉進(jìn)行超低溫保存并解凍，測(cè)定花粉萌發(fā)率顯示，桃葉衛(wèi)矛花粉超低溫保存的最適含水量為4.14%。

桃葉衛(wèi)矛屬兩性花，在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，桃葉衛(wèi)矛的雄花容易受到外界惡劣氣候的影響，導(dǎo)致出現(xiàn)花期不遇、結(jié)實(shí)率低的問(wèn)題，而通過(guò)花粉超低溫保存可以有效解決這樣的問(wèn)題。此外，桃葉衛(wèi)矛花粉超低溫保存還可以為其雜交育種提供優(yōu)良的花粉，為進(jìn)一步培育新品種提供了一條有效途徑。

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