嚴(yán) 國， 王元元， 羅 成， 齊江姣， 牟 云， 高劍峰

(石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆石河子 832003)

布魯氏菌病簡稱布病，是由布魯氏桿菌引起的嚴(yán)重危害人民健康和農(nóng)牧業(yè)發(fā)展的人畜共患傳染病，是《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的乙類傳染病，羊為該病最主要的傳染源[1]。調(diào)查顯示，2012—2014年新疆牛羊布病陽性率呈逐年上升趨勢[2]。因此，這一疾病對新疆這一畜牧業(yè)主產(chǎn)區(qū)所造成的損失也逐年增長，遏制該疾病的傳播已成為亟待解決的重大問題。

主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)是脊椎動物的高度多態(tài)性基因群[3]。MHC蛋白的主要功能是抗原遞呈，在機體的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，與許多疾病的抗病性和易感性密切相關(guān)，MHC作為相關(guān)性研究的候選基因，受各研究領(lǐng)域的密切關(guān)注，已經(jīng)成為現(xiàn)代分子遺傳研究的焦點。綿羊的MHC位于20號染色體，MHCⅡ區(qū)與人的相似，區(qū)域內(nèi)的 DQ 和 DR 2個基因家族表現(xiàn)豐富的多態(tài)性[4]，而綿羊的多態(tài)性更集中在 DQ 家族[5-7]。

單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)，是指由單個堿基的變化引起DNA序列發(fā)生改變的多態(tài)性，是基因組序列內(nèi)最為常見的變異形式。SNP作為第三代分子遺傳標(biāo)記，本身具有顯著特點，如數(shù)量多、分布廣泛、且穩(wěn)定遺傳等[8]。這些特點在疾病相關(guān)基因的研究中發(fā)揮著尤為重要的作用，尤其是那些位于基因編碼區(qū)的SNPs，可能會使基因編碼的蛋白質(zhì)的產(chǎn)量或質(zhì)量發(fā)生改變，使其與某種疾病的發(fā)生直接相關(guān)，因而備受各研究領(lǐng)域的關(guān)注[9]。由于單個SNP在復(fù)雜疾病中所起到的作用微小[10-11]，而由SNPs構(gòu)建的單倍型提供的遺傳信息卻比單個的SNP更多、更準(zhǔn)確、更符合多基因疾病的遺傳性，所以單倍型分析越來越成為復(fù)雜疾病關(guān)聯(lián)研究的有效工具，這為相關(guān)免疫性狀的關(guān)聯(lián)研究及抗病分子標(biāo)記輔助選擇奠定了一定的基礎(chǔ)。因此，本研究通過 PCR-SSCP 技術(shù)結(jié)合測序的方法檢測哈薩克羊的MHC-DQB2 exon3的多態(tài)位點，探討SNPs與布魯氏菌病易感性相關(guān)性，此外構(gòu)建其單倍型，并初步推測與布魯氏菌病易感性相關(guān)的單倍型，為今后開展布魯氏菌抗性分子標(biāo)記輔助選擇研究提供了一定的依據(jù)，為進一步定位具有易感性的遺傳位點而最終進行抗病育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣本來源 本試驗所用血液樣本部分(45支)來自于新疆維吾爾自治區(qū)畜牧獸醫(yī)站，全部為布魯氏菌病陽性；部分(100支)采自新疆烏蘇市3個羊場，以頸靜脈采血法采血 5 mL 于肝素鈉抗凝管，4 ℃保存，以備基因組DNA提取。

1.1.2 主要試劑 布魯氏菌檢測試劑盒購自哈藥集團生物疫苗有限公司；Tris平衡酚購自北京索萊寶科技有限公司；引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成；瓊脂糖為西班牙瓊脂糖(Biowest Agarose)；2×TaqPCR Master Mix 和 DL 2000 marker購自北京天根公司；過硫酸銨購自美國Sigma公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、TEMED購自美國Promega公司；親和硅烷、剝離硅烷購自北京鼎國生物技術(shù)中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 布魯氏菌陽性檢測 采用虎紅平板檢測法對100只哈薩克綿羊進行布魯氏菌檢測，在干凈載玻片上取30 μL被檢綿羊血清與等量的虎紅平板抗原混合均勻，在5 min內(nèi)以陽性血清反應(yīng)為對照，觀察并記錄結(jié)果，被檢血清出現(xiàn)較為明顯的顆粒狀或絮狀凝集則判定為布魯氏菌陽性，否則判定為陰性。以同樣的方法對所有樣品重復(fù)檢測2次，以確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確。

1.2.2 基因組DNA的提取與檢測 基因組DNA的提取：取2 mL無明顯血凝塊的新鮮血液，采用酚-氯仿法對其進行基因組DNA提取。

DNA純度與濃度的檢測：采用生物光譜計檢測DNA純度和濃度，用Plate assay法和瓊脂糖凝膠電泳法對DNA驗證的濃度及純度進行驗證，并對高濃度樣品進行適當(dāng)稀釋，于 -18 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 引物設(shè)計 參照綿羊MHC-DQB2的基因序列(GenBank登錄號：EU176819)，利用引物設(shè)計軟件 Primer Premier 5.0設(shè)計該基因exon3的特異引物。引物序列為：F：5′-CCTCAGTGGAACCTACAGTGACC-3′；R：5′-TGCCC TTACTCCACTCCACCG-3′。

1.2.4 PCR擴增 PCR擴增體系為：上下游引物各 0.75 μL，模板3.5 μL，無菌雙蒸水7 μL，2×TaqPCR Master Mix 8 μL，總體積20 μL。PCR擴增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸40 s，35 個循環(huán)；72 ℃ 延伸8 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。

1.2.5 SSCP電泳 取3 μL的PCR產(chǎn)物與10 μL的變性上樣緩沖液(去離子甲酰胺9.5 mL；0.3%二甲苯青0.1 mL；0.5 mol/L EDTA 0.4 mL，pH值8.0)充分混勻，于PCR儀 98 ℃ 變性10 min，立即冰浴驟冷至少3 min，低溫恒溫循環(huán)系統(tǒng)溫度恒定至9 ℃，取10 μL變性產(chǎn)物上樣于10%的非變性聚丙酰胺凝膠(Acr ∶Bis=39 ∶1)，300 V預(yù)電泳15 min，而后3 W恒定功率過夜電泳10 h。次日電泳結(jié)束后，銀染顯色并在X光片觀片燈上分析帶型并拍照保存。

1.2.6 PCR擴增及測序 經(jīng)PCR -SSCP分析之后，選取不同基因型樣本，重新進行PCR擴增并電泳檢測后，送至北京六合華大基因公司進行測序。測序結(jié)果用DNASTAR軟件進行比對分析。

1.2.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析 利用Excel整理統(tǒng)計數(shù)據(jù)，采用χ2適合性檢驗法分別分析病例組與正常組哈薩克羊MHC-DQB2基因exon3多態(tài)位點的基因頻率和基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg(HWE)平衡定律，P>0.001表示無統(tǒng)計學(xué)差異，符合Hardy-Weinberg平衡定律，反之P<0.001 則說明不符合Hardy-Weinberg平衡定律。所有統(tǒng)計學(xué)分析均采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包，通過比較分析每個SNP的基因頻率或基因型頻率分別在病例組和正常組中的差異性，從而分析其與布魯氏菌病易感性的相關(guān)性。

1.2.8 單倍型構(gòu)建 去除等位基因頻率<0.05以及不符合Hardy-Weinberg平衡定律的SNPs位點，選擇同時符合以上2個條件的位點，用SHEsis在線軟件進行單倍型的構(gòu)建，取連鎖不衡系數(shù)(D′值)作為連鎖不平衡指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 布魯氏菌檢測

采用虎紅平板凝集試驗檢測綿羊種布魯氏菌陽性，結(jié)果在100個哈薩克羊個體中檢出布魯氏菌陰性個體84個，陽性個體為16個，布魯氏菌陽性檢出率為16%，檢測結(jié)果如圖1所示。

2.2 基因組DNA的提取電泳檢測

哈薩克羊全血中提取的基因組DNA經(jīng)生物光譜計和Plate assay法檢測，發(fā)現(xiàn)基因組DNA濃度在40～1 000 μg/mL。純度經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，出現(xiàn)整齊、清晰的單一條帶，符合后期試驗要求。

2.3 MHC-DQB2基因的PCR擴增結(jié)果檢測

將哈薩克羊MHC-DQB2 exon3 PCR擴增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠檢測，檢測結(jié)果與DL 2000 marker比較與預(yù)期的相符，因而判斷為目的片段。

2.4 SSCP分析

分別對病例、正常組哈薩克羊個體MHC-DQB2 exon3的PCR擴增產(chǎn)物進行SSCP電泳，部分電泳結(jié)果見圖2。由于本試驗應(yīng)用PCR-SSCP方法具有高度靈敏性，所以出現(xiàn)的基因型比較多，是否還有一些其他未檢測出的基因型，還有待于擴大樣本數(shù)量以進一步研究。

2.5 哈薩克羊MHC-DQB2基因exon3 SNPs分析

通過PCR-SSCP技術(shù)及測序的序列比對結(jié)果分析，哈薩克羊MHC-DQB2基因exon3在282 bp內(nèi)共發(fā)現(xiàn)22個多態(tài)位點，經(jīng)Hardy-Weinberg平衡定律檢驗無差異統(tǒng)計學(xué)意義，表明具有群體代表性。這些位點中不存在插入和缺失位點，有1個位點屬于四態(tài)性，1個位點屬于三態(tài)性，其余20個位點屬于二態(tài)性。這些二態(tài)性位點中轉(zhuǎn)換位點有16個，包括8個A/G轉(zhuǎn)換位點和8個C/T轉(zhuǎn)換位點；顛換位點有4個，包括A/T顛換位點2個，A/C、G/C顛換位點各1個。相比而言，轉(zhuǎn)換率為顛換率的4倍，這可能是因為CpG(堿基C、G以及連接兩者的磷酸酯鍵 p)結(jié)構(gòu)上的胞嘧啶殘基是基因組中最易發(fā)生突變的位置，大多數(shù)是甲基化的，可自發(fā)地脫去氨基形成堿基T，因此導(dǎo)致了C→T(互補鏈上G→C)的突變增多，從而導(dǎo)致了轉(zhuǎn)換位點遠(yuǎn)高于顛換位點[12]。

2.6 哈薩克羊MHC-DQB2基因exon3的單氨基酸多態(tài)性(SAP)分析

對哈薩克羊DQB2 exon3氨基酸序列進行分析，在93個氨基酸位點中，有20個屬于氨基酸多態(tài)位點，占總氨基酸位點數(shù)的21.5%。其中，有6個氨基酸突變?yōu)橛辛x突變，其余均為無義突變(表1)。

2.7 哈薩克羊MHC-DQB2 exon3多態(tài)性與布魯氏菌病易感性的關(guān)系

許多疾病的抗性和易感性都與MHC有關(guān)聯(lián)，作為針對某些疾病的抗性和易感性的候選基因的MHC，已經(jīng)成為現(xiàn)代分子免疫遺傳的研究熱點之一。本研究對MHC-DQB2基因的多態(tài)性與布魯氏菌病易感性進行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，MHC-DQB2可能是與布魯氏菌病易感性相關(guān)的基因之一。哈薩克羊MHC-DQB2 exon3 每個SNP的等位基因及基因型頻率在病例組和正常組中的分布差異見表2、表3，其中140 A/C/T/G位點、155T/C的等位基因在病例和正常樣本中的分布存在顯著差異(P<0.05)，初步分析認(rèn)為MHC-DQB2 exon3的140 A/C/T/G、155T/C與綿羊布魯氏菌病易感性相關(guān)，相關(guān)的研究內(nèi)容目前尚未見報道。針對該基因每個多態(tài)位點的基因型進行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)位點AA/Aa/aa基因型在病例和正常樣本中的分布無顯著差異(P>0.05)。

表1 哈薩克羊MHC-DQB2基因exon3的SNPs位點及氨基酸變異位點

表2 中國美利奴羊MHC-DQB2基因exon3基因頻率

注：“*”表示病例組與正常對照組中國美利奴羊MHC-DQB2相同等位基因間差異顯著(P<0.05)。

2.8 病例和正常組MHC-DQB2 exon3的連鎖不平衡分析及單倍型的構(gòu)建

對符合Hardy-Weinberg平衡定律的SNPs位點進行連鎖不平衡分析，通過SHSsis在線軟件[13]計算連鎖不平衡系數(shù)D′值，觀察各位點之間的連鎖不平衡程度，判斷是否存在連鎖不平衡。在MHC-DQB2 exon3的22個SNPs位點中，最終篩選出符合條件的18個位點進行單倍型的構(gòu)建，連鎖不平衡圖見圖3。方格內(nèi)數(shù)字就是連鎖不平衡系數(shù)D′值乘以100譬如99表示D′=0.99。D′值越大，意味著相關(guān)聯(lián)的2個SNPs間連鎖不平衡程度越強。通常認(rèn)為D′>0.9為高度連鎖，D′>0.7 認(rèn)為2個SNPs位點位于同一個Block區(qū)域，可以進行單倍型分析。圖3中各個方塊的顏色由淺至深，表示連鎖程度由低到高。經(jīng)連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)整個MHC-DQB2 exon3存在7個LD Block(表4)，將其依次命名為Block1～Block7。

表3 中國美利奴羊MHC-DQB2基因exon3基因型頻率

注：基因型表示為AA/Aa/aa(其中A代表高頻率等位基因；a代表低頻率等位基因)； AH代表高頻率基因名稱；AL代表低頻率基因名稱。

由于一個群體中單倍型的頻率不能<0.03，因此單倍型頻率未達到0.03的未參與統(tǒng)計，對應(yīng)的單倍型組合也應(yīng)忽略，SHEsis在線軟件在單倍型分析過程中，系統(tǒng)會自動刪除不符合條件的單倍型組合，因而哈薩克羊MHC-DQB2 exon3最終分析了21種單倍型組合(表3、表4)，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)在病例組中Hap4、Hap6頻率都顯著低于正常組(P<0.05)，這表明這2個單倍型可能與布魯氏菌病抗性有關(guān)，或者說具有這2個單倍型的個體對布魯氏菌病不易感，其中，Hap6頻率在病例和正常組中存在極顯著差異(P<0.01)；病例組Hap9頻率顯著高于正常組(P<0.05)，表明具有這一單倍型的個體可能更易感布魯氏菌病。綜合推測，這2種單倍型可能與布魯氏菌病易感性具有相關(guān)性。

表4 每個連鎖不平衡 block 中 SNPs 組成

3 討論

MHC ClassⅡ區(qū)段是一段具有高度多態(tài)性的基因，相對于人而言，綿羊的基因多態(tài)性在DQ區(qū)較之DR區(qū)更為豐富。因此，本研究選取了DQB2 exon3作為研究對象，通過PCR-SSCP技術(shù)結(jié)合測序技術(shù)， 對哈薩克羊DQB2 exon3進行了多態(tài)性分析，最終發(fā)現(xiàn)了22個SNPs位點，而其中只有2個位點在病例和正常組間存在顯著差異；在22個SNPs位點中只有6個位點為單氨基酸多態(tài)位點(SAPs)，其他位點均為無義突變，且都是由密碼子的簡并性引起的。對比發(fā)現(xiàn)，本研究有義突變率較之其他研究成果[14-15]低，這可能是由exon3與exon2所編碼的氨基酸鏈在MHC蛋白上所處的位置及其所發(fā)揮的功能不同引起的，也有可能是因為綿羊品種的不同造成的。MHC蛋白的主要功能是抗原遞呈，在機體的免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著非常重要的作用，與家畜的抗病性和易感性有著密切的關(guān)系。本研究通過對MHC-DQB2 exon3多態(tài)性與綿羊布魯氏菌病易感性相關(guān)性研究，初步篩選了與布魯氏菌病易感性相關(guān)的SNPs位點，但由于MHC是一組緊密連鎖的基因群，在一條染色體上的等位基因很少發(fā)生同源染色體間的交換，構(gòu)成了一個單體型(單倍型)，在遺傳過程中MHC單體型是以一個完整的遺傳單位由親代傳給子代[16]。因此，本研究對符合要求的SNPs位點構(gòu)建了單倍型，得到了3種與布魯氏菌病易感性相關(guān)的單倍型，其中有2個單倍型在病例和正常組間達到了顯著差異水平(P<0.05)，1個達到了極顯著差異水平(P<0.01)。這為今后開展布魯氏菌抗性分子標(biāo)記輔助選擇研究提供了一定依據(jù)，為進一步尋找具有易感性遺傳位點而最終進行抗病育種奠定了基礎(chǔ)，但MHC-DQB2 exon3 的2個SNP位點及3個單倍型能否作為抗布魯氏菌病的遺傳標(biāo)記，還需要對這些哈薩克羊個體進行攻毒試驗以進一步驗證以及其如何參與綿羊布魯氏菌病的發(fā)生和發(fā)展的機制仍需進一步研究探討。

表5 病例和正常組MHC-DQB2 exon3單倍型分析

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