文/東天 胡紅霞

北京市鱘魚、鮭鱒魚創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)專欄

分子標(biāo)記輔助育種（Marker-assisted selection breeding）是分子育種手段中的一種，是通過利用與目標(biāo)性狀緊密連鎖的DNA分子標(biāo)記對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行間接選擇的現(xiàn)代育種技術(shù)。分子標(biāo)記輔助育種不僅可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)育種過程中形態(tài)學(xué)標(biāo)記數(shù)目少、受環(huán)境影響大、選擇準(zhǔn)確性較低的不足，而且可以進(jìn)行早期選擇，大大提高育種效率。

鱘魚是目前世界上最古老的魚類之一，素有“活化石”之稱。鱘魚渾身上下都是寶，其卵做成的魚子醬更有“黑色黃金”的美譽(yù)。鱘魚因其重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值而成為我國重要的淡水養(yǎng)殖品種。由于鱘魚性成熟晚，繁殖周期長，育種的世代間隔很長，僅通過傳統(tǒng)手段開展鱘魚育種周期太長，從而限制了優(yōu)良品種的選育。利用分子標(biāo)記輔助育種對(duì)鱘魚一些重要經(jīng)濟(jì)性狀，如抗病、繁殖、生長等數(shù)量性狀的分子標(biāo)記開發(fā)和應(yīng)用能夠?qū)崿F(xiàn)親魚的早期選擇，大大縮短世代間隔和育種周期。目前，世界許多國家通過分子生物技術(shù)手段開展了對(duì)不同種鱘魚遺傳多樣性分析、種質(zhì)資源保護(hù)、遺傳背景檢測、功能基因克隆等方面的研究。與發(fā)達(dá)國家相比，我國在鱘魚育種方面的研究起步晚，因此，采用現(xiàn)代分子育種技術(shù)，特別是通過分子標(biāo)記輔助選擇手段可以盡快實(shí)現(xiàn)我國鱘魚種群進(jìn)行優(yōu)良種質(zhì)資源開發(fā)、品種改良、種群高效合理選育及經(jīng)濟(jì)性狀育種。

一、分子標(biāo)記輔助育種在鱘魚上的應(yīng)用

（一）鱘魚系統(tǒng)進(jìn)化分析

線粒體DNA（mtDNA）是一種核外遺傳物質(zhì)，具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、排列緊密，進(jìn)化速度快、母系遺傳等特征，廣泛用于進(jìn)化研究和種群遺傳分析。Genbank已報(bào)道水產(chǎn)動(dòng)物mtDNA全序列超過100種，為鱘魚開展mtDNA研究提供了大量的通用引物，可根據(jù)不同進(jìn)化速率的mtDNA基因片段進(jìn)行鱘魚的系統(tǒng)發(fā)育研究。目前以鱘魚線粒體DNA為試驗(yàn)材料對(duì)鱘科魚類進(jìn)化關(guān)系的研究很多，且主要集中在將鱘魚類線粒體D-loop部分序列、細(xì)胞色素b、12s rRNA、16s rRNA等基因作為分子標(biāo)記進(jìn)行研究。Ludwig等對(duì)19種鱘屬及1種白鱘屬共計(jì)1238條鱘魚的mtDNA控制區(qū)進(jìn)行研究，表明種間異質(zhì)性存在于所有品種中。Krieger等通過mtDNA序列探究北美鱘形目魚類系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，表明美洲白鱘與中吻鱘、湖鱘與短吻鱘均為姐妹類群。張四明等研究者首次檢測了我國鱘形目魚類共12種mtDNA ND4L和ND4基因序列，表明鰉屬可歸并到鱘屬，達(dá)氏鱘與中華鱘親緣關(guān)系最近且環(huán)太平洋地區(qū)鱘科魚類可能有共同的起源。本課題組對(duì)我國五種鱘魚線粒體DNA控制區(qū)不同種類串聯(lián)重復(fù)序列的研究發(fā)現(xiàn)達(dá)氏鰉和史氏鱘重復(fù)序列單元相似度為82.93%，西伯利亞鱘和俄羅斯鱘相似度為90.59%,并推測不同地理區(qū)域相同五種的重復(fù)序列可能發(fā)生過分子內(nèi)重組。通過對(duì)鱘魚系統(tǒng)進(jìn)化分析，為我國建立鱘魚遺傳基因信息資源提供了平臺(tái)，并對(duì)今后鱘魚選育、選配及雜交育種等提供有效依據(jù)。

（二）鱘魚遺傳多樣性及種質(zhì)鑒定研究

遺傳多樣性是一個(gè)群體內(nèi)不同個(gè)體遺傳變異的總和，是生物多樣性中一個(gè)重要而又獨(dú)特的組成部分。目前，遺傳多樣性的檢測方法已由形態(tài)學(xué)水平、細(xì)胞學(xué)水平和生理生化水平發(fā)展到分子水平。通過分子標(biāo)記手段在DNA水平上對(duì)個(gè)體間或群體內(nèi)遺傳變異進(jìn)行檢測，可以為保種、維持物種遺傳多樣性提供依據(jù)，為種群內(nèi)的選育提供基礎(chǔ)，為未知的市場需求提供了足夠的應(yīng)變能力，也有助于制定科學(xué)的育種措施。由于不同鱘魚種間的基因組差異明顯，因此鱘魚多樣性的研究主要是利用微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)。May等在1997年首次檢測出湖鱘的11個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)。2009年，Timoshkina等通過RAPD、微衛(wèi)星及mtDNA標(biāo)記等方法檢測俄羅斯三個(gè)地區(qū)（Azov，Caspian和Black sea）俄羅斯鱘群體多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)在4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上，Caspian群體多態(tài)性最強(qiáng)，Azow群體最弱。2013年，Ogden等通過RAD測序法對(duì)意大利鱘、俄羅斯鱘、波斯鱘和西伯利亞鱘基因組SNPs多態(tài)性進(jìn)行檢測。我國對(duì)不同種類鱘魚群體遺傳多樣性也有深入研究，彭濤等利用12對(duì)湖鱘微衛(wèi)星引物對(duì)小體鱘、史氏鱘和西伯利亞鱘及三種雜交鱘進(jìn)行種間通用性研究，結(jié)果表明引物通用性較高。牛翠娟等對(duì)北京和重慶兩個(gè)養(yǎng)殖場后備親魚史氏鱘和達(dá)氏鰉遺傳多樣性進(jìn)行研究，檢測出養(yǎng)殖場間品種內(nèi)多態(tài)位點(diǎn)很少，遺傳變異很小。

在鱘魚養(yǎng)殖過程中，一些養(yǎng)殖場存在不規(guī)范引種的情況導(dǎo)致大量雜交鱘存在，從外觀上無法分辨，引起鱘魚種質(zhì)混亂，在育種過程中嚴(yán)重影響品種間選配效果、雜種優(yōu)勢的利用，大大降低了育種效率。魚子醬是鱘魚養(yǎng)殖上具有重要經(jīng)濟(jì)效益的產(chǎn)品之一，近些年來有研究發(fā)現(xiàn)，由于市場上魚子醬價(jià)格懸殊，出現(xiàn)了一些以次充好、種質(zhì)來源錯(cuò)標(biāo)的現(xiàn)象。因此需要建立一套鱘魚種質(zhì)鑒定體系，從根本上解決種質(zhì)混亂的問題，推動(dòng)鱘魚育種產(chǎn)業(yè)發(fā)展。Jenneckens等檢測出一個(gè)可以鑒定閃光鱘及其魚子醬制品的特異性微衛(wèi)星位點(diǎn)LS-39。Chassaing等成功研究出通過5個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記的五個(gè)突變位點(diǎn)鑒別西歐三種鱘魚品種的方法。姜彥超等利用6個(gè)高多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)俄羅斯鱘雌核發(fā)育后代進(jìn)行基因型分析，判斷其為雜合后代、基因重組后代或完全雌核發(fā)育后代。

（三）鱘魚功能基因與基因組研究

關(guān)于水產(chǎn)動(dòng)物基因組學(xué)上的研究，目前已獲得鯉魚、羅非魚、虹鱒、斑點(diǎn)叉尾鮰、半滑舌鰨和大黃魚等養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類的全基因組序列，并開展了豐富的功能基因相關(guān)研究。與這些魚類相比，鱘魚染色體數(shù)量龐大，且為多倍體，目前尚未獲得完整的全基因組序列的報(bào)道，因此對(duì)于功能基因及基因組學(xué)相關(guān)研究的開展相對(duì)緩慢。近些年，鱘魚cDNA文庫構(gòu)建及EST標(biāo)簽的篩選成為研究熱點(diǎn)。陳金平等通過SSH技術(shù)構(gòu)建了史氏鱘精巢和卵巢組織SMART cDNA文庫。Hale等用新一代焦磷酸測序技術(shù)對(duì)湖鱘性腺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，并對(duì)焦磷酸測序技術(shù)的準(zhǔn)確性及測序密度進(jìn)行檢測。Cao等從一條24齡雌性中華鱘中構(gòu)建了腦垂體cDNA文庫，含有2025個(gè)ESTs。Vidotto等通過454測序法對(duì)一條雄性納氏鱘及兩條全同胞雌鱘構(gòu)建性腺及腦的cDNA文庫，質(zhì)控后共篩選出大于55000個(gè)高質(zhì)量ESTs。對(duì)鱘魚基因組信息的探究有助于發(fā)現(xiàn)和了解鱘魚經(jīng)濟(jì)性狀功能基因，為檢測并獲得更多分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)，對(duì)開展鱘魚分子標(biāo)記輔助育種具有重要意義。

在對(duì)鱘魚功能基因篩選及表達(dá)水平檢測方面，研究者們也取得了一些方面的進(jìn)展。早在1995年，Bidwell和Carlson對(duì)白鱘卵黃蛋白原基因（VTG）進(jìn)行研究，在雄魚和雌魚肝臟中均檢測到VTG mRNA存在，其cDNA編碼186kDa蛋白。Trabucchi等對(duì)白鱘兩種生長激素抑制素（SSR1/SSR2）進(jìn)行研究，分別克隆了cDNA序列并進(jìn)行mRNA組織分布研究，推測其具有促垂體功能。Yom等對(duì)俄羅斯鱘生長激素（GH）進(jìn)行表達(dá)研究，發(fā)現(xiàn)俄羅斯鱘GH基因cDNA全長980bp，與哺乳動(dòng)物GH cDNA序列一致性達(dá)到66%～70%，在表達(dá)水平上，5齡的雄性和雌性鱘魚GH表達(dá)水平無顯著差異。Yue等克隆了中華鱘下丘腦-垂體-性腺軸上另一個(gè)基因--促性腺激素釋放激素（GnRH），并研究17β-雌二醇對(duì)其表達(dá)調(diào)控的作用。同時(shí)，在鱘魚經(jīng)濟(jì)性狀相關(guān)功能基因不斷被挖掘出來的背景下，已有研究者開始對(duì)功能基因進(jìn)行基于SNPs分子標(biāo)記的多態(tài)性檢測。He等對(duì)中華鱘脂蛋白脂肪酶（LPL）和肝脂酶（HL）基因進(jìn)行SNPs多態(tài)性檢測并與對(duì)配方飼料適應(yīng)度性狀關(guān)聯(lián)分析，共發(fā)現(xiàn)了7個(gè)位于內(nèi)含子的SNPs，并驗(yàn)證出這些SNPs與攝食性狀有關(guān)。由于SNP分子標(biāo)記在基因組上分布廣，且可以穩(wěn)定遺傳，被廣泛用于候選基因關(guān)聯(lián)分析和功能組學(xué)驗(yàn)證。目前，鱘魚SNP分子標(biāo)記的開發(fā)仍處于起步階段，未來，對(duì)于功能性SNP的篩選及基于SNP分子標(biāo)記芯片的開發(fā)對(duì)開展鱘魚分子標(biāo)記輔助育種不斷助力。

二、展望

鱘魚渾身都是寶，不僅肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富，還具有滋補(bǔ)、保健等藥用功效，隨著人民生活水平逐漸提高，對(duì)鱘魚的消費(fèi)需求也逐年升高。我國鱘魚人工養(yǎng)殖工作開展較晚，但發(fā)展迅速，由于很多養(yǎng)殖場缺乏系統(tǒng)規(guī)范的人工繁育管理方法，使得近些年國內(nèi)鱘魚養(yǎng)殖場親魚種質(zhì)退化或基因滲入現(xiàn)象嚴(yán)重。因此，科學(xué)的養(yǎng)殖和高效的現(xiàn)代育種技術(shù)顯得尤為重要。以生物技術(shù)為核心的分子育種方法對(duì)國內(nèi)現(xiàn)有品種或品系進(jìn)行種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性檢測、新品種培育以及建立合理選種選配平臺(tái)具有重要意義，隨著基因工程的深入開展勢必會(huì)在鱘魚育種領(lǐng)域帶來十分廣闊的應(yīng)用前景。

在基因組信息基礎(chǔ)研究方面，隨著生物技術(shù)手段的不斷發(fā)展，在未來有望實(shí)現(xiàn)鱘魚多倍體基因組的全基因組測序，檢測大量多態(tài)性的分子標(biāo)記并繪制高分辨率的遺傳連鎖圖譜，這些遺傳基礎(chǔ)研究為實(shí)現(xiàn)全基因組育種提供平臺(tái)和保障。在種質(zhì)資源研究方面，發(fā)展更簡單和快捷的種質(zhì)鑒定方法，建立養(yǎng)殖場親魚的遺傳信息庫，優(yōu)化選種、選配制度。養(yǎng)殖場優(yōu)良純種親魚和群體間豐富的遺傳資源多樣性為雜交育種、良種選育、品種培育等提供基礎(chǔ)。在功能性狀改良方面，在鱘魚上主要關(guān)注生長性狀、繁殖性狀（包括產(chǎn)卵數(shù)、卵品質(zhì)、性腺發(fā)育程度、性別分化等）、抗病性狀、體色性狀等等。通過對(duì)這些性狀候選基因的研究，獲得大量與性狀相關(guān)多態(tài)性分子標(biāo)記，并探究這些標(biāo)記與表型的關(guān)聯(lián)性，從而實(shí)現(xiàn)鱘魚親魚的早期選擇、良種的鑒定，為優(yōu)良親魚的選擇提供依據(jù)，大大縮短育種的世代間隔和育種準(zhǔn)確性，獲得經(jīng)濟(jì)效益。