孫宗科，李琳,李亞鵬, 張瑩,馮海霞,車團結(jié),高愷,

1.甘肅省醫(yī)療器械檢驗檢測所，甘肅蘭州 730000；2.甘肅省功能基因組與分子診斷重點實驗室，甘肅蘭州 730000

幽門螺桿菌（Helicobacter pylori，以下簡稱HP），自1983年被成功地從胃鏡活檢標本中培養(yǎng)出來[1]，關于消化性潰瘍HP存在的意義引起國內(nèi)外專家的重視。1994年世界衛(wèi)生組織/國際癌癥研究機構(gòu)（WHO/IARC）將幽門螺桿菌定為I類致癌原。有研究表明[2]患有消化性疾病患者口腔Hp與其胃粘膜內(nèi)的形態(tài)學和生物學特征相似，具有同源性。治療HP感染的常用方法是質(zhì)子泵抑制劑加兩種抗生素的三聯(lián)療法,但隨之產(chǎn)生的耐藥菌株的增多, 使得療效下降, 感染復發(fā)率高。近年來, 利用微生態(tài)制劑通過多種途徑拮抗病原菌, 減少了耐藥性的發(fā)生, 為控制細菌感染性疾病提供了新的途徑[3]。有研究結(jié)果表明[4]，某種特定的乳酸菌對幽門螺桿菌具有抑制乃至殺滅作用，可以緩解甚至治愈幽門螺桿菌引起的相關疾病，因此，在醫(yī)學上有很好的應用價值。乳酸菌抗幽門螺桿菌感染的效果已經(jīng)在大量實驗中得到證實[5]。目前臨床上將其作為抗生素療法的佐劑有一定的療效。本文通過研究口腔乳酸菌對幽門螺桿菌的拮抗作用，旨在為應用微生態(tài)療法治療HP感染提供一定的理論基礎。

1. 材料和方法

1.1 材料

植物乳酸菌標準菌株、副干酪乳酸菌標準菌株從酸奶中分離、口腔唾液幽門螺旋桿菌由甘肅省生物芯片工程實驗室提供。選擇性腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基, TPY瓊脂培養(yǎng)基以及MRS瓊脂培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術有限公司。

1.2 方法

采用直接點種法、反點種菌落計數(shù)法、活菌與幽門螺旋桿菌液體共培養(yǎng)法、細菌培養(yǎng)基上清液與幽門螺旋桿菌共培養(yǎng)、滅活細菌與幽門螺旋桿菌液體共培養(yǎng)法觀測2種乳酸菌對幽門螺旋桿菌的拮抗作用。

1.2.1 直接點種法[6-7]

配置1×108、1×107CFU·mL-1的幽門螺旋桿菌菌懸液和1×108、1×107、1×106CFU·mL-1的乳酸菌菌懸液（植物乳酸菌和副干酪乳酸菌）。以1:10來配置含有幽門螺旋桿菌菌懸液的TPY瓊脂培養(yǎng)基。用無菌移液器各取5μL不同濃度的乳酸菌菌懸液分別點種在含乳酸菌菌懸液的TPY瓊脂培養(yǎng)基上，對照組為點種相同劑量的0.9%氯化鈉的培養(yǎng)基。各處理中都設置兩個平行實驗，在微氧環(huán)境下培養(yǎng)24h后觀察有無抑菌圈出現(xiàn)。

1.2.2 反點種菌落計數(shù)法[8]

以1:10來配置含有乳酸菌菌懸液（1×108CFU.mL-1）的TPY瓊脂培養(yǎng)基，對照組為不含乳酸菌菌懸液的TPY瓊脂培養(yǎng)基。用0.9%氯化鈉將已配置的幽門螺旋桿菌菌懸液持續(xù)稀釋至1×103CFU.mL-1。用無菌移液器每次吸取5 μL幽門螺桿菌菌懸液置于各平板上點種6個點。將培養(yǎng)基置于微氧環(huán)境下培養(yǎng)24h后觀察每個點的幽門螺旋桿菌菌落變化。

1.2.3 活菌與幽門螺旋桿菌液體共培養(yǎng)法

分別配置1×108CFU·mL-1的幽門螺旋桿菌和兩種乳酸菌菌懸液，用無菌移液器各取100μL幽門螺旋桿菌和兩種乳酸菌菌懸液于2mL TPY瓊脂培養(yǎng)基（1:10）上共培養(yǎng)，共設置5組用于觀察。對照組為培養(yǎng)5組各含100μL幽門螺旋桿菌菌懸液的1mL TRY瓊脂培養(yǎng)基。將其都放置于微氧環(huán)境下培養(yǎng)120h,其中每隔24h取出一組連續(xù)稀釋至1×103CFU·mL-1，各取20μL稀釋液點種于選擇性腦心浸液培養(yǎng)基上，于24h之后數(shù)菌落，每組重復3次。

1.2.4 細菌培養(yǎng)基上清液與幽門螺旋桿菌液體共培養(yǎng)

配置1×108CFU.mL-1的兩種乳酸菌菌懸液?；旌暇鶆? mL乳酸菌菌懸液與9 mL TPY瓊脂培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h。之后各取 2mL液體培養(yǎng)基于2000 r.min-1離心5 min，提取1 mL上清液與已制的幽門螺桿菌菌懸液（1×108CFU.mL-1）1mL共同培養(yǎng)于8mL TPY瓊脂培養(yǎng)基（1:10）中。以 0.9%氯化鈉溶液1 mL與幽門螺旋桿菌菌懸液1 mL培養(yǎng)于8mLTPY瓊脂培養(yǎng)基中為對照組。連續(xù)培養(yǎng)120h，每隔24h取出1mL菌懸液倍比稀釋至1×103CFU.mL-1，各取20μL稀釋液點種于選擇性腦心浸液培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24h后進行菌落計數(shù)，并將結(jié)果換算成對數(shù)值，每組重復3次。

1.2.5 滅活細菌與幽門螺旋桿菌液體共培養(yǎng)法

將植物乳酸菌和副干酪乳酸菌分別點種在MRS瓊脂平板上，在37 ℃培養(yǎng)24h，在紫外燈下0.5 m處照射平板2h。照射后將菌轉(zhuǎn)移至另一個MRS瓊脂平板經(jīng)37 ℃培養(yǎng)24h，觀察有無菌落產(chǎn)生來確定細菌是否已滅活。結(jié)果顯示兩個平板上均未出現(xiàn)菌落，證明此兩種乳酸菌均已滅活。制備滅活菌菌懸液（1×108CFU.mL-1）。實驗設為3組，包括1mL植物乳酸菌菌懸液或者1mL副干酪乳酸菌與1mL幽門螺旋桿菌菌懸液置于8 mL液體培養(yǎng)基中（實驗組），以及1mL 0.9%氯化鈉溶液與1mL幽門螺旋桿菌菌懸液置于8mL TPY液體培養(yǎng)基中（對照組），將它們都連續(xù)培養(yǎng)120h，每隔24h取出1mL菌懸液倍比稀釋至1×103CFU.mL-1后，取20μL稀釋液點種于選擇性腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)24h后進行菌落計數(shù)，并將結(jié)果換算成對數(shù)值，每組重復3次。

1.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0 軟件進行統(tǒng)計分析，反點種菌落計數(shù)法組間均數(shù)比較用單因素方差分析，其余試驗結(jié)果均采用重復測定方差分析，檢驗水平P=0.05。

2. 結(jié) 果

2.1 直接點種法

幽門螺桿菌菌懸液1×108CFU.mL-1和乳酸菌（植物乳酸菌和副干酪乳酸菌）菌懸液（1×108、1×107、1×106CFU·mL-1）的混合液均未出現(xiàn)抑菌圈。幽門螺桿菌菌懸液1×107CFU.mL-1和植物乳酸菌菌懸液1×108的抑菌圈直徑為0.71mm和0.72mm，和植物乳酸菌1×107的混合液的抑菌圈直徑為0.73mm和0.73mm，和副干酪乳酸菌1×108CFU.mL-1的混合液的抑菌圈直徑為0.70mm和0.74mm。

2.2 反點種菌落計數(shù)法

口腔乳酸菌（植物乳酸菌和副干酪乳酸菌）軟瓊脂上的幽門螺桿菌菌落數(shù)較對照組減少（P＜0.05）?？瞻讓φ丈希琓PY上點種幽門螺桿菌稀釋樣，隨著菌落濃度的稀釋狀況觀察，濃度越來越小其菌落生長越稀疏。

2.3 活菌與幽門螺旋桿菌液體共培養(yǎng)法

根據(jù)各個時間點菌落數(shù)的對數(shù)值（取平均值）繪制的幽門螺桿菌生長變化曲線見圖1。統(tǒng)計分析表明：在各個時間點上乳酸菌與對照組之間菌落計數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）。2個實驗組幽門螺桿菌菌落數(shù)目在24、48、72和96h均低于正常對照組，說明2種乳酸菌可抑制幽門螺桿菌的生長。

圖1 乳酸菌與幽門螺旋桿菌液體共培養(yǎng)中幽門螺旋桿菌的生長變化曲線Fig.1 Growth crve of Helicobacter pylori in mixted culrure with bacteria

2.4 細菌培養(yǎng)基上清液與幽門螺桿菌液體共培養(yǎng)

根據(jù)各個時間點菌落數(shù)的對數(shù)值表（取平均值）繪制的幽門螺桿菌生長變化曲線見圖2。統(tǒng)計分析表明：在24、48、72h時間點上，各實驗組與對照組之間菌落數(shù)計數(shù)差異均有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）；多數(shù)時間點上，各實驗組間菌落計數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（p＞0.05）?？傮w來講，2種乳酸菌上清液對幽門螺桿菌的生長具有抑制作用，但是隨著時間的推移，這種抑制作用呈現(xiàn)衰退趨勢。與活菌與幽門螺桿菌液體共培養(yǎng)的結(jié)果做橫向比較，二者結(jié)果基本一致，說明2種乳酸菌可分泌某種物質(zhì)從而產(chǎn)生對幽門螺桿菌的拮抗作用。

圖2 細菌培養(yǎng)基上清液與幽門螺桿菌液體共培養(yǎng)中幽門螺桿菌的生長變化曲線Fig.2 Growth curve of Helicobacter pylori in mixted culture with supernate of bacteria culture media

2.5 滅活細菌與幽門螺桿菌液體共培養(yǎng)法

根據(jù)各個時間點菌落數(shù)的對數(shù)值表（取平均值）繪制的幽門螺桿菌生長變化曲線見圖3。從圖3可見，各組細菌總量呈下降趨勢，但對照組與實驗組之間數(shù)據(jù)波動大，曲線呈交織狀，尚不能肯定2種乳酸菌在此種處理下對幽門螺桿菌仍有抑制作用。

圖3 滅活的細菌與幽門螺桿菌液體共培養(yǎng)中幽門螺桿菌的生長變化曲線Fig.3 Growth curve of Helicobacter pylori in mixed culture with killed bacteria.

3 討 論

Hp 是慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌、胃粘膜組織相關淋巴瘤的主要致病因素。1989 年Krajden 等首次從胃炎患者牙菌斑中分離出Hp，推測口腔可能是Hp的胃外聚集地。之后，大量研究證實口腔Hp感染在一定程度上與胃內(nèi)Hp感染相關，唾液和牙菌斑可作為Hp的長期儲存場所[9-10],且口腔Hp與其相對應的胃內(nèi)Hp具有相同的基因型，不同定植部位的Hp可能來自同一菌株或是不相同菌株的突變體[11-12]，Hp 架起了口腔疾病與消化道疾病的一座橋梁。流行病學調(diào)查資料顯示，我國Hp感染率處在40%～70%水平[13]，全國胃癌發(fā)病率以西北地區(qū)甘肅最高[14]，目前， 不少患者已經(jīng)對臨床治療幽門螺桿菌感染的藥物產(chǎn)生抗性；多重抗菌藥物會擾亂腸道內(nèi)微生態(tài)平衡；尤其是抗生物療法容易產(chǎn)生耐藥性。在發(fā)展中國家，80%～90%HP臨床分離株對甲硝唑具有耐藥性，在歐洲耐藥菌株也高達25.6%，導致三聯(lián)藥物療效降低，甚至失效，感染復發(fā)率高[15]。

乳酸菌屬于益生菌之列，具有抑制人畜腸道致病菌，加強腸道正常菌群，限制需氧菌群生長，維持腸道微生態(tài)環(huán)境的平衡以及增加機體免疫、調(diào)整代謝酶活性等功能，因此乳酸菌已被國內(nèi)外廣泛應用與食品工業(yè)、醫(yī)療保健、乳制品工業(yè)、飼料加工業(yè)等生產(chǎn)工業(yè)中。孫珊等[16]在一次體外試驗中測試了7種乳酸菌抗菌素物質(zhì)對不同幽門螺桿菌菌株的抑菌活性, 發(fā)現(xiàn)細菌素的抑菌能力是隨著幽門螺桿菌菌株的不同而改變的, 來自于乳酸乳球菌的兩種乳鏈球菌素A164和BH5在所測細菌素中顯示出了最強的抑菌活性。龍敏等[17]的研究認為人嗜酸乳桿菌在體外對HP毒力株具有明顯拮抗作用，他篩選出4株對HP毒力株有明顯拮抗作用的嗜酸乳桿菌。植物乳酸菌和副干酪乳酸菌作為兩種常見乳酸菌，在本次研究中被選取來觀察其與幽門螺旋桿菌體外生長的關系。實驗結(jié)果顯示這兩種乳酸菌均可抑制幽門螺旋桿菌的體外生長和繁殖。直接點種法實驗中，濃度為1×107CFU.mL-1的幽門螺旋桿菌菌懸液與1×107和1×108CFU.mL-1的植物乳酸菌以及1×108CFU.mL-1均產(chǎn)生出明顯的抑菌圈，因此可以推斷這兩種乳酸菌可能分泌某種抗菌物質(zhì)來抑制幽門螺旋桿菌。在兩種乳酸菌活體和上清液與幽門螺旋桿菌共培養(yǎng)實驗中，結(jié)果都顯示均對于幽門螺旋桿菌有明顯抑制作用。通過各實驗組的幽門螺旋桿菌菌落計數(shù)來繪制的生長曲線顯示，抑制作用逐漸衰減，特別是在72h或者96h之后。由此可以推測衰減的抑制作用可能與細菌生長環(huán)境的改變以及細菌自身的生長繁殖周期有關。最后，為明確此種拮抗作用是否還有可能來源于細菌組成成分，將滅活菌體和幽門螺旋桿菌進行共同培養(yǎng)，但得到的數(shù)據(jù)不穩(wěn)定，波動性較大，無法得出準確結(jié)論。

口腔細菌種類繁多，細菌之間相互作用的研究還有待深入，其中乳酸菌的開發(fā)與利用國內(nèi)研究得已經(jīng)很普遍，然而有關其作用機理方面研究的試驗卻報道的不多，特別有關對致病菌生長作用的影響試驗更為少見。本文的研究將對重建口腔有益菌群的優(yōu)勢狀態(tài)、口腔疾病、消化道疾病的預防和治療具有重大幫助。