柳娜　楊文雄

摘要：研究轉(zhuǎn)錄因子DREB1A在植物抗?jié)B透脅迫反應(yīng)中的作用。根據(jù)GenBank中登錄的DREB1A基因的序列設(shè)計(jì)引物，用PCR方法從擬南芥中克隆DREB1A基因，利用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體pCAMB1A1300-DREB1A。該結(jié)果為進(jìn)一步利用DREB1A基因做遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)錄因子；DREB1A基因；植物表達(dá)載體

中圖分類號：Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1001-1463（2018）11-0029-03

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2018.11.009

Cloning of Transcription Factor DREB1A Gene and Construction of Plant Expression Vector

LIU Na， YANG Wenxiong

（Institute of Wheat， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：To research the function of the transcription factor DREB1A in plant tolerance to osmotic stress， a pair of primers was designed according to the sequence of DREB1A gene in GenBank databases. The DREB1A gene was cloned from Arabidopsis thaliarra by the method of PCR. By the method of Recombinant DNA Technology， plant expression vector pCAMB1A1300-DREB1A was successfully constructed. The results laid a foundation for further research on genetic transformation using DREB1A gene.

Key words：Transcription factor； DREB1A gene； Plant expression vector

干旱、鹽堿和低溫等逆境是影響作物生長發(fā)育的主要限制因子，改善環(huán)境脅迫的耐受性對提高作物產(chǎn)量具有重要意義[1 - 3 ]。環(huán)境脅迫能誘導(dǎo)許多植物基因的表達(dá)，有些基因的表達(dá)產(chǎn)物可直接增強(qiáng)脅迫耐性，有些可以感應(yīng)和轉(zhuǎn)導(dǎo)脅迫信號調(diào)控基因表達(dá)[4 - 5 ]。因此，抗逆相關(guān)基因的克隆、表達(dá)調(diào)控及功能分析等研究，為作物抗逆育種提供了潛在的有效途徑。干旱又是制約甘肅小麥生產(chǎn)的首要因素，提高小麥對干旱脅迫的耐受性來增加小麥產(chǎn)量，將極大地提高甘肅應(yīng)對糧食安全問題的能力。加強(qiáng)具有抗旱基因資源的發(fā)掘和創(chuàng)新，開展抗旱生理和遺傳學(xué)研究，利用基因工程技術(shù)實(shí)現(xiàn)不同物種間抗旱基因的轉(zhuǎn)移，提高植物的耐旱能力，是目前研究的熱點(diǎn)之一[6 ]。植物的耐旱性是一個復(fù)雜的多基因控制系統(tǒng)，而轉(zhuǎn)錄因子有一部分與抗逆性有關(guān)，參與滲透脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和功能基因表達(dá)調(diào)控，在植物抗?jié)B透脅迫反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[7 - 11 ]。已有的研究表明，DREB是個小基因家族，編碼3個相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子， DREBlA是這個小基因家族的重要成員之一，它對抗?jié)B透脅迫基因的啟動起著“ 主開關(guān)”的作用， 在逆境脅迫下主動調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)， 并在脅迫信號傳遞中起重要作用。我們從擬南芥中克隆轉(zhuǎn)錄因子DREBlA，并構(gòu)建由CaMV35S啟動子調(diào)控的植物表達(dá)載體，旨在為進(jìn)一步利用DREBlA基因做小麥遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

哥倫比亞生態(tài)型擬南芥幼苗由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所種質(zhì)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室提供。pMD19-T vector、pCAMBIA1300-N-eGFP載體、大腸桿菌菌株DH5a均購自大連寶生物工程有限公司。

Taq酶、氨卞青霉素、卡拉霉素、IPTG、X-gal、T4 DNA連接酶、DNA回收試劑盒等其他試劑均購自TaKaRa公司，引物合成和基因測序由北京六合華大基因科技股份有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 擬南芥葉片基因組 RNA 的提取 使用植物基因組試劑盒提取擬南芥葉片基因組RNA，然后通過RT-PCR反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，用設(shè)計(jì)好的上下游引物擴(kuò)增DREB1A基因，采用1%的瓊脂糖凝膠檢測 DNA 的完整性。

1.2.2 DREB1A基因克隆及載體構(gòu)建 根據(jù)Genebank中擬南芥DREB1A基因序列（登錄號：EF156749），應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件分析其內(nèi)部酶切位點(diǎn)情況。設(shè)計(jì)1對引物，并根據(jù)后續(xù)構(gòu)建植物表達(dá)載體的需要，在上游引物一端加入l個XbaI位點(diǎn)，在下游引物一端加入了BamH I位點(diǎn)。設(shè)計(jì)PCR引物如下：上游引物D1：5GCTCTAGA ATGAACTCATTTTCTGCT-3XbaI；下游引物D2：5GCCCTAGG GTCGCATCACACATCTC 3 BamHI。PCR反應(yīng)體系總體積為50.0 μL，包括5xbuffer 10.0 μL、10 mmol/L上游引物1.0 μL、下游引物1.0 uL，2.5 mmol/L dNTP 4.0 μL，模板cDNA 1.0 μL，Primer STAR 1.0 μL加ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2.0 min、94 ℃ 30 sec、55 ℃ 30 sec、72 ℃ 1.0 min。35個循環(huán)后72 ℃延伸10.0 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖電泳檢測后，擴(kuò)增片段大小為561 bp（圖1）。將擴(kuò)增片段用DNA凝膠回收試劑盒回收純化（操作程序根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行，回收后的DNA片段加A尾。連接到克隆載體pMD19-T載體，將經(jīng)PCR檢測和XbaI/BamH I雙酶切鑒定呈陽性的克隆命名為T-DREB1A，送交北京六合華大基因科技股份有限公司測序，采用DNAMAN軟件分析比對測序結(jié)果。

1.2.3 擬南芥DREB1A基因表達(dá)載體的構(gòu)建 將測序合適的T-DREB1A載體質(zhì)粒用核酸內(nèi)切酶XbaI和BamH II酶切，回收DREB1A片段。同時將pCAMBIA1300-N-eGFP載體用此2個酶切，回收載體?；厥针p酶切產(chǎn)物，用T4DNA 連接酶將DREB 1A片段接到pCAMBIA1300載體中。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞。菌液PCR鑒定構(gòu)建的DREB1A基因植物表達(dá)載體，并將陽性克隆送交北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 DREB1A基因的克隆與測序結(jié)果

分別以DI、D2為上下游引物，以cDNA模板，擴(kuò)增出561 bp的特異帶，與預(yù)期的DREB1A基因大小相符（圖1）。將擴(kuò)增片段鏈接到克隆載體pMD19-T，測序后與GenBank中的擬南芥DREB基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明2個序列完全一致，說明獲得的擬南芥DREB基因編碼區(qū)是正確的，沒有發(fā)生堿基變化，可以用來構(gòu)建植物表達(dá)載體。

2.2 植物表達(dá)載體p1300-DREB1A構(gòu)建

用前向帶有XbaI和反向帶有BamH I酶切位點(diǎn)的擬南芥DREB基因引物，以pMD19-T-DREB 質(zhì)粒為模板，經(jīng)內(nèi)切酶切割回收目的片段。目的片段回收純化后，用XbaI和BamH I酶切，連接到用相同酶切回收后的表達(dá)載體pCAMBIA1300上，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，獲得pCAMBIA1300-DREB表達(dá)載體（圖2）。對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增出一條長約561 bp的目的基因條帶（圖3）。將陽性克隆測序，序列比對結(jié)果正確，說明擬南芥DREB 基因表達(dá)載體構(gòu)建成功。

3 結(jié)論與討論

用PCR方法從擬南芥中克隆了DREB1A基因，序列分析發(fā)現(xiàn)克隆的DREB1A基因與已發(fā)表的DREB1A基因序列（EF156749）的同源性為99.85%。利用基因重組技術(shù)成功構(gòu)建了由CaMV35S啟動于調(diào)控的植物表達(dá)載體p1300-DREB1A.為進(jìn)一步利用DREB 1A基因綜合改良植物抗旱性奠定基礎(chǔ)。

植物感受外界干旱、高鹽、激素、病害及體內(nèi)細(xì)胞發(fā)育等信號，通過一系列信號傳遞激發(fā)轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子與基因啟動子區(qū)域的順式作用元件結(jié)合后，激活RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，從而啟動基因的的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，最后通過基因產(chǎn)物的作用對外界信號在生理生化等方面做出適合的調(diào)節(jié)反應(yīng)。DREB轉(zhuǎn)錄因子參與對干旱 、高鹽和低溫等逆境脅迫的應(yīng)答，介導(dǎo)植物非ABA依賴的滲透脅迫信號的傳遞。DREB 轉(zhuǎn)錄因子可以和DRE順式元件或具有DRE核心序列的元件特異性結(jié)合，調(diào)控下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，提高對低溫、干旱和高鹽的抗性。因此，DREB類轉(zhuǎn)錄因子在基因的表達(dá)調(diào)控方面起著非常重要的作用。目前，已從不同的作物中克隆到這類轉(zhuǎn)錄因子，并對其功能進(jìn)行了研究。

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（本文責(zé)編：楊 杰）