郭佳文 季佳鑫 陳佳明 劉思伯

摘 要：剖析了厭氧氨氧化菌種低溫保藏的影響因素，保藏溫度對(duì)厭氧氨氧化顆粒污泥特性的影響，間歇性饑餓對(duì)厭氧氨氧化菌混培物保藏特性的影響。最后指出，厭氧氨氧化菌種低溫保藏的條件。

關(guān)鍵詞：厭氧氨氧化；保藏條件；條件影響

研究厭氧氨氧化菌混合物的保藏方法的研究有利于環(huán)境的進(jìn)一步凈化，而保藏工藝有利于氨氧化菌的保存，以更好的減少污染凈化環(huán)境，而收集文獻(xiàn)的目的是為了更好地證明這種保藏方法的正確性[1，2]。

1.厭氧氨氧化菌低溫保藏的影響因素

1.1保藏溫度

厭氧氨氧化菌對(duì)溫度變化比較敏感，在正常進(jìn)行厭氧氨氧化反應(yīng)階段，所需的最佳溫度范圍是6～43℃。然而保藏厭氧氨氧化菌種時(shí)，保藏溫度也會(huì)影響厭氧氨氧化菌的生存狀態(tài)及后期恢復(fù)活性時(shí)的速度，因而選擇恰當(dāng)?shù)谋２販囟戎陵P(guān)重要[3]。

1.2保護(hù)劑

1.2.1海藻糖

海藻糖是生物組織的非特異性天然保護(hù)劑，屬于非滲透性低溫保護(hù)劑，可使動(dòng)植物和微生物等有機(jī)體在冷凍、高溫、脫水、高滲透壓及有毒試劑等環(huán)境中仍保持生命活力。可見，低溫下添加海藻糖有助于減緩低溫?fù)p害，但海藻糖的添加量需結(jié)合具體保藏條件而具體設(shè)定。然而，迄今尚未見海藻糖在厭氧氨氧化菌種保藏中使用的報(bào)道。

1.2.2二甲亞砜

DMSO也是一種常見的冷凍保護(hù)劑，在常溫下其毒性較強(qiáng)，其毒性隨著溫度的降低而減小，如在低溫下（4℃）添加DMSO，可降低其對(duì)細(xì)胞的毒害作用。DMSO還具有抗凝集作用，可促使單個(gè)細(xì)胞正常生存。

1.2.3甘油

作為一種常見的冷凍保護(hù)劑，甘油的使用在實(shí)驗(yàn)室中較常見.它能降低冷凍液的滲透壓，減緩細(xì)胞受滲透壓的脅迫，它還能滲透進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)來平衡細(xì)胞內(nèi)的水分

1.3保藏時(shí)間

保藏時(shí)間也會(huì)影響菌種保藏效果.所需要的保藏時(shí)間不同，相應(yīng)的保藏方法也有所差別。一般而言，菌體活性會(huì)隨著保藏時(shí)間的延長先下降后趨于穩(wěn)定，若保藏時(shí)間較短時(shí)，采用常溫保藏法既不會(huì)對(duì)菌體活性變化產(chǎn)生顯著影響，又能節(jié)省成本；當(dāng)保藏時(shí)間較長時(shí)，低溫的選取也需盡可能地實(shí)現(xiàn)“雙贏”（活性抑制程度不受影響，節(jié)約成本）。

1.4基質(zhì)條件

保藏菌種的培養(yǎng)基如何配制也是值得考慮的部分。硝酸鹽作為緩沖劑，在活性恢復(fù)時(shí)會(huì)隨著保藏時(shí)間的不同出現(xiàn)不同的遲滯效應(yīng)[4]。有學(xué)者也用過蒸餾水和葡萄糖分別作為基質(zhì)，發(fā)現(xiàn)以蒸餾水為基質(zhì)的效果較好。

進(jìn)行厭氧氨氧化菌種保藏時(shí)，菌種保藏環(huán)境（保藏溫度、保護(hù)劑的選擇、基質(zhì)等）的設(shè)定直接關(guān)系到細(xì)菌的生存狀態(tài)。在上述諸多保藏方法中，如今廣泛應(yīng)用的是冷凍法，甘油和海藻糖是較為推薦的保護(hù)劑，但添加合適濃度的DMSO，菌種活性恢復(fù)效果很好。保護(hù)劑的使用與保藏溫度和保藏時(shí)間息息相關(guān)，菌種活性恢復(fù)效果更是依賴于保藏環(huán)境和解凍過程?？傊?，無論是保藏環(huán)境還是解凍處理，都與厭氧氨氧化菌本身的生理特性有關(guān)。千篇一律地使用一種保藏方法，以及采用雷同的操作條件均不足取，需結(jié)合實(shí)際現(xiàn)有條件具體分析[5]。

2.保藏溫度對(duì)厭氧氨氧化顆粒污泥特性的影響

實(shí)驗(yàn)首先通過 HRT 調(diào)控進(jìn)水基質(zhì)負(fù)荷培養(yǎng)厭氧氨氧化顆粒污泥，并采用 KHCO3 和 NaHCO3 交替提供無機(jī)碳源。然后分別在–40 ℃、4 ℃、（27±4） ℃室溫和 35 ℃條件下避光保藏。結(jié)果表明，NaHCO3 可代替 KHCO3 作為厭氧氨氧化菌生長的無機(jī)碳源。相比于其他保藏溫度，4 ℃保藏能夠較好地維持生物量和生物活性，同時(shí)能較好地維持顆粒污泥的沉降性能、顆粒污泥和細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性。同時(shí)，顆粒污泥胞外聚合物中蛋白質(zhì)與多糖的比值 （PN/PS） 和血紅素不能有效指示保藏過程中顆粒污泥沉降性能和活性的變化，而生物活性與胞溶程度呈負(fù)相關(guān)[6]。

3.間歇性饑餓對(duì)厭氧氨氧化菌混培物保藏特性的影響

3.1間歇性饑餓對(duì)厭氧氨氧化菌混培物的危害

大于長期性饑餓，且亞硝態(tài)氮濃度越高產(chǎn)生的危害越大。采用 R1（4℃）、R2（4℃并每隔10 d換一次NO2- /NH4+為1.32的基質(zhì)）、R3 （4℃并每隔10 d換一次 NO2-/NH4+為1.63的基質(zhì)）3種方法保藏的厭氧氨氧化菌混培物，活性均先快速下降后趨于穩(wěn)定，但三者的衰減速率始終為 R1< R2

3.2厭氧氨氧化菌混培物活性與血紅素 c含量有直接相關(guān)性，保藏過程中的血紅素 c含量衰減速率與活性衰減速率趨于一致.無外界顏色干擾時(shí)厭氧氨氧化菌混培物顏色可直觀反映其活性和血紅素c 含量，但有外界干擾時(shí)顏色與活性和血紅素 c含量間無任何相關(guān)性[7]。

3.3饑餓保藏過程中，高濃度亞硝酸鹽條件下厭氧氨氧化菌體死亡自溶現(xiàn)象更嚴(yán)重，但厭氧氨氧化菌混培物的顆粒結(jié)構(gòu)及其富含的胞外多聚物增強(qiáng)了其抵抗外界不利因素的能力。

目前為止，有關(guān)厭氧氨氧化菌保藏的報(bào)道還僅見低溫和常溫的保藏方法。 對(duì)于動(dòng)物來說，早有實(shí)驗(yàn)表明動(dòng)物短期饑餓后其食欲會(huì)增大，如果間歇性饑餓對(duì)于厭氧氨氧化菌來說有同樣功效的話那將是環(huán)境工程界的幸事，尤其對(duì)于厭氧氨氧化菌的保藏來說。

結(jié)論：厭氧氨氧化菌為自養(yǎng)菌，當(dāng)環(huán)境中存在有機(jī)物時(shí)，其基質(zhì)亞硝酸鹽易受反硝化菌的競爭。厭氧氨氧化菌對(duì)環(huán)境條件 （如水質(zhì)、溫度） 敏感，對(duì)毒性物質(zhì)適應(yīng)能力較差。迄今為止，厭氧氨氧化工藝的應(yīng)用僅局限于少數(shù)幾種低 C/N 和易生物處理的廢水。因此研究最適宜的菌種保藏條件對(duì)厭氧氨氧化工藝的推廣應(yīng)用具有重大的現(xiàn)實(shí)意義。總之，無論是保藏環(huán)境還是解凍處理，都與厭氧氨氧化菌本身的生理特性有關(guān)。千篇一律地使用一種保藏方法，以及采用雷同的操作條件均不足取，需結(jié)合實(shí)際現(xiàn)有條件具體分析。

參考文獻(xiàn)：

[1]汪彩華[6]，鄭平，胡安輝.硝化產(chǎn)物對(duì)硝化細(xì)菌混培物保藏特性的影響[J].中國環(huán)境科學(xué)，2011，31（10）：1663-1668.

[2]汪彩華，鄭平，蔡靖等.厭氧氨氧化菌混培物保藏方法的研究[J].中國環(huán)境科學(xué)，2013，33（8）：1474-1482.

[3]李祥，鄭宇慧，黃勇等.保存溫度及時(shí)間對(duì)厭氧氨氧化污泥活性的影響[J].中國環(huán)境科學(xué)，2011，31（1）：56-61.

[4] 唐崇儉，鄭平，陳建偉.流加菌種對(duì)厭氧氨氧化工藝的影響[J].生物工程學(xué)報(bào)， 2011，27（1）： 1-8.

[5]于英翠，高大文，陶彧等.利用序批式生物膜反應(yīng)器啟動(dòng)厭氧氨氧化研究[J].中國環(huán)境科學(xué)，2012，32（5）：843-849.

[6]唐崇儉，鄭平，陳建偉，等.基于基質(zhì)濃度的厭氧氨氧化工藝運(yùn)行策略[J].化工學(xué)報(bào)，2009，60（3）：718-725.

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