吳凡 胡文龍 許卜方 王千秋

210042南京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病研究所性病防治室（第一作者現(xiàn)在南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院皮膚科，211100）

最新研究結(jié)果顯示，神經(jīng)梅毒患者腦脊液中多種趨化因子配體（CXCL13、CXCL8、CXCL10等）濃度顯著高于無神經(jīng)梅毒的梅毒患者，且驅(qū)梅治療后濃度恢復(fù)正常，腦脊液中的這些CXCL具有成為診斷神經(jīng)梅毒標志物的潛力［1］。CXCL6也被稱為粒細胞趨化蛋白2，具有激活中性粒細胞、誘導(dǎo)T細胞遷徙和促血管生成等作用。Linge等［2］發(fā)現(xiàn)CXCL6自身也具有極高的抗菌活性，可通過附著于細菌表面導(dǎo)致細菌膜破裂。CXCL8即白細胞介素8，是一種促炎細胞因子，在招募中性粒細胞進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的過程中發(fā)揮重要作用，同時CXCL8直接參與中性粒細胞在內(nèi)皮細胞表面的移動［3］。機體中CXCL10表達水平變化與感染、免疫功能異常和腫瘤等誘導(dǎo)的炎癥有關(guān)，在多種疾病中，CXCL10被公認為預(yù)測疾病嚴重程度的生物標志物［4］。Brissette等［5］報道伯氏螺旋體刺激后人腦微血管內(nèi)皮細胞（human brain microvascular endothelial cell，HBMEC）中CXCL1、CXCL2、CXCL6和CXCL8等多種趨化因子配體表達升高。我們前期研究［6］證實，梅毒螺旋體可以依附于體外培養(yǎng)的HBMEC。本研究中，我們利用新鮮提取的有活性梅毒螺旋體刺激HBMEC，觀察該細胞中CXCL6、CXCL8和CXCL10基因和蛋白表達水平，進一步探討HBMEC在神經(jīng)梅毒發(fā)病中的作用。

材料與方法

一、材料

1.動物和細胞來源：3月齡成年雄性新西蘭大白兔購自江蘇省金陵種兔場［許可證號：SCXK（蘇）2012-0003，動物合格證號：NO.201602656］，體重2.5～3 kg，梅毒螺旋體明膠凝集試驗和快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片實驗均陰性，按要求飼養(yǎng)于南京軍區(qū)軍事醫(yī)學(xué)研究所動物實驗中心。梅毒螺旋體株（Nichols株）由廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院楊天賜教授饋贈。原代HBMEC來自美國Cell Systems公司，人類急性早幼粒白血病細胞株（HL-60細胞）來自中國科學(xué)院細胞庫。

2.主要試劑和材料：內(nèi)皮細胞完全培養(yǎng)液（美國Cell Systems公司），RPMI 1640培養(yǎng)基、脂多糖、噻唑藍（MTT）和二甲基亞砜（DMSO）（美國Sigma公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），兔血清（自制），TRIzol試劑（美國Invitrogen公司），SYBR green實時熒光定量PCR檢測試劑盒（大連 TaKaRa公司），CXCL6、CXCL8、CXCL10定量ELISA試劑盒（美國R&D公司），Transwell培養(yǎng)板（美國Corning公司）。

3.主要儀器：全波長酶標儀（美國Thermo Scientific公司），熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)：HBMEC和HL-60細胞分別接種于內(nèi)皮細胞完全培養(yǎng)液和含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，均置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。HBMEC傳代3～6次后進行實驗。為誘導(dǎo)HL-60細胞分化為類中性粒細胞，向培養(yǎng)液中加入1.5%DMSO刺激5 d。

2.梅毒螺旋體培養(yǎng)和收集：按文獻［6］培養(yǎng)和收集有毒力的梅毒螺旋體，用內(nèi)皮細胞完全培養(yǎng)液稀釋為1.6×107條/ml的梅毒螺旋體懸液。取部分螺旋體懸液于56℃水浴鍋中熱處理30 min制成滅活的梅毒螺旋體懸液。

3.反轉(zhuǎn)錄（RT）-PCR檢測HBMEC中CXCL6、8、10 mRNA表達水平：將HBMEC按1×106個/孔接種于6孔板中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h。移去舊培養(yǎng)液，加入新鮮提取的有活性梅毒螺旋體懸液（梅毒螺旋體組）或滅活（滅活梅毒螺旋體組）菌懸液，以含200 μg/L脂多糖為陽性對照組，以只含細胞培養(yǎng)液的孔作為空白對照組，每孔設(shè)置3個復(fù)孔，于37℃、5%CO2孵箱中分別培養(yǎng)6、12和24 h。棄舊液，加磷酸鹽緩沖液清洗細胞3次，每孔加入1 ml TRIzol試劑，反復(fù)吹打，直到液體變成清亮的粉紅色，置于-80℃冰箱中凍存。

采用氯仿法提取細胞總RNA，檢測RNA純度和濃度后將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-80℃冰箱中凍存。運用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物序列，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。CXCL6正向引物：5′-CCTGTCTCTGCTGTGCTGAC-3′，反向引物：5′-CACTTCCACCTTGGAGCACT-3′；CXCL8正向引物：5′-CCTGTCTCTGCTGTGCTGAC-3′，反向引物：5′-CACTTCCACCTTGGAGCACT-3′；CXCL10正向引物：5′-GAACTGTACGCTGTACCTGC A-3′，反向引物：5′-TTGATGGCCTTCGATTCTGGA-3′；β肌動蛋白正向引物：5′-CAGGCACCAGGGCGT GATGG-3′，反向引物：5′-CGATGCCGTGCTCGATGG GG-3′。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)。以β肌動蛋白作為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計算目的基因的表達倍數(shù)。

4.ELISA法檢測HBMEC培養(yǎng)上清液中CXCL6、CXCL8和CXCL10含量：將HBMEC按每孔5×104個接種于96孔板中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，加入新鮮提取的有活性或滅活梅毒螺旋體懸液刺激HBMEC，以含脂多糖（200 μg/L）的孔作為陽性對照組，以只含細胞培養(yǎng)液的孔為空白對照組，每孔設(shè)置3個復(fù)孔，于37℃、5%CO2孵箱中分別培養(yǎng)6、12、24 h，取細胞培養(yǎng)上清液，置-20℃冰箱中凍存。按ELISA試劑盒說明書進行操作，檢測不同處理組HBMEC培養(yǎng)上清液中CXCL6、CXCL8和CXCL10含量。

5.HL-60細胞遷移實驗：將HBMEC按每孔5×105個接種于24孔板中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)24 h，棄舊培養(yǎng)基，分別加入1.6×107條/ml梅毒螺旋體懸液和滅活菌懸液，以只含細胞培養(yǎng)液的孔為空白對照組，將Transwell小室放入24孔板中，按每孔2×105個將提前誘導(dǎo)的HL-60細胞加入上室中，每孔設(shè)3個復(fù)孔，置于37℃、5%CO2孵箱中分別培養(yǎng)6、12和24 h。收集下室中的上清液，150g離心5 min，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液重懸細胞，接種于96孔板中，每孔加入10 μl 0.5%MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，150×g離心10 min，棄上清液，每孔加入100 μl DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀在570 nm波長處測定各孔A值。

6.統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 17.0軟件進行分析，計量資料以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，若方差齊，進行SNK檢驗；若方差不齊，則進行Games-Howell檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、不同處理組HBMEC中CXCL6、CXCL8和CXCL10 mRNA表達

6、12和24 h時各組間CXCL6 mRNA、CXCL8 mRNA、CXCL10 mRNA相對表達水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。組間比較顯示，在各時間點梅毒螺旋體組中CXCL6、CXCL8和CXCL10 mRNA表達水平均顯著高于空白對照組和滅活梅毒螺旋體組（均P＜0.05）；梅毒螺旋體組中CXCL6和CXCL8 mRNA表達水平與脂多糖組比較，均P＜0.05，而CXCL10 mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；滅活梅毒螺旋體組3種基因mRNA表達水平與空白對照組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），與脂多糖組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。見表1。

表1 不同處理組中人腦微血管內(nèi)皮細胞趨化因子配體（CXCL）6、CXCL8和CXCL10 mRNA的相對表達水平（±s）

表1 不同處理組中人腦微血管內(nèi)皮細胞趨化因子配體（CXCL）6、CXCL8和CXCL10 mRNA的相對表達水平（±s）

注：n=3。a與脂多糖組比較，P＜0.05；b與空白對照組比較，P＜0.05；c與梅毒螺旋體組比較，P＜0.05

組別CXCL6梅毒螺旋體組滅活梅毒螺旋體組脂多糖組空白對照組F值P值CXCL8梅毒螺旋體組滅活梅毒螺旋體組脂多糖組空白對照組F值P值CXCL10梅毒螺旋體組滅活梅毒螺旋體組脂多糖組空白對照組F值P值6 h 12 h 24 h 5.001±0.322a b1.052±0.012a c7.791±0.936 1.035±0.073 132.073＜0.05 13.129±0.554a b1.019±0.073a c14.522±0.958 1.121±0.030 533.007＜0.05 8.197±1.020a b0.986±0.041a c21.688±2.652 1.136±0.024 774.608＜0.05 7.118±0.908a b1±0.011a c9.393±0.428 1.11±0.109 213.377＜0.05 15.898±1.572a b1.076±0.095a c28.063±3.521 1.078±0.095 767.931＜0.05 24.261±2.906a b1.053±0.117a c34.583±4.084 1.065±0.118 404.303＜0.05 14.436±1.379b1.053±0.024a c13.317±1.247 1.023±0.024 191.272＜0.05 17.238±1.993b1.057±0.084a c16.855±3.754 0.997±0.014 239.889＜0.05 27.877±3.626b1.020±0.131a c24.867±1.627 1.018±0.012 164.905＜0.05

二、不同處理組HBMEC上清液中CXCL6、CXCL8和CXCL10蛋白含量

單因素方差分析顯示，在6、12和24 h時4組間CXCL6（F值分別為 229.960、573.247、522.244，均P＜0.05）和 CXCL8（F值分別為 268.029、342.715、496.257，均P＜0.05）的含量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見圖1。兩兩比較顯示，梅毒螺旋體組CXCL6和CXCL8含量高于空白對照組和滅活梅毒螺旋體組（均P＜0.05），而滅活梅毒螺旋體組CXCL6和CXCL8含量與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

梅毒螺旋體組CXCL6含量隨培養(yǎng)時間延長呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，12 h時達最高峰，且各時間點間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=189.540，P＜0.05），見圖1A；而CXCL8含量隨培養(yǎng)時間延長逐漸升高，各時間點間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=353.578，P＜0.05），見圖1B。各時間點梅毒螺旋體組、滅活梅毒螺旋體組和空白對照組間CXCL10差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見圖1C。

三、各組HL-60細胞遷移情況

Transwell細胞遷移實驗結(jié)果顯示，在6、12和24 h時3組間Transwell小室下室中遷移的HL-60細胞數(shù)量均存在組間差異（F值分別為291.317、131.279、589.958，均P＜0.05）。組間比較顯示，在各時間點梅毒螺旋體組Transwell小室下室中遷移的HL-60細胞數(shù)量顯著高于空白對照組和滅活梅毒螺旋體組（均P＜0.05）；而后2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

討 論

梅毒螺旋體對CNS有一定的親和性，有研究顯示，梅毒螺旋體感染人體后不久即可出現(xiàn)在腦脊液中，24%未治療的梅毒患者腦脊液中可發(fā)現(xiàn)梅毒螺旋體，一期梅毒患者腦脊液中梅毒螺旋體陽性率高達40%［7］。動物模型［8］和梅毒螺旋體基因分型研究結(jié)果［9-11］均證實存在具有CNS親和性的梅毒螺旋體亞型。血腦屏障作為一個由HBMEC、星形膠質(zhì)形成細胞和周細胞等成分構(gòu)成的特殊結(jié)構(gòu)，是CNS抵御病原微生物侵襲的第一道防線。HBMEC作為血腦屏障中最重要的成分，一方面是血腦屏障物理屏障的實質(zhì)成分，另一方面HBMEC受到病原微生物的刺激后會分泌趨化因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子等物質(zhì)激活宿主的免疫系統(tǒng)［12］。我們利用新鮮提取的具有活性的梅毒螺旋體刺激HBMEC，觀察細胞中CXCL6、CXCL8和CXCL10的變化情況，探討HBMEC在神經(jīng)梅毒發(fā)病過程中的作用。

表2 不同處理組人腦微血管內(nèi)皮細胞對HL-60細胞遷移的影響（A570，±s）

表2 不同處理組人腦微血管內(nèi)皮細胞對HL-60細胞遷移的影響（A570，±s）

注：n=3。a與空白對照組和滅活梅毒螺旋體組比較，P＜0.05

組別梅毒螺旋體組滅活梅毒螺旋體組空白對照組F值P值6 h 0.734±0.014a0.518±0.012 0.512±0.011 291.317＜0.05 12 h 0.822±0.022a0.556±0.008 0.559±0.028 131.279＜0.05 24 h 1.017±0.015a0.528±0.024 0.524±0.020 589.958＜0.05

本研究中，有活性的梅毒螺旋體刺激HBMEC后CXCL6和CXCL8在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平均顯著升高，而滅活的梅毒螺旋體未引起這些變化。值得一提的是，CXCL10 mRNA雖然高表達，但細胞培養(yǎng)上清液中CXCL10的含量與空白對照和滅活梅毒螺旋體組間無明顯差異。這可能與mRNA翻譯和翻譯后調(diào)控有關(guān)，具體原因尚需后續(xù)研究深入分析。

CXCL6、CXCL8和CXCL10是一類對中性粒細胞有趨化和激活作用的細胞因子，因此我們利用Transwell細胞遷移實驗探討梅毒螺旋體刺激后HBMEC對中性粒細胞的吸引能力。HL-60細胞經(jīng)DMSO誘導(dǎo)后可分化為成熟的類中性粒細胞，表達多種中性粒細胞分子標志物，同時也具備吞噬能力，是中性粒細胞相關(guān)研究的良好替代模型［13］。我們利用HL-60細胞替代中性粒細胞進行實驗，結(jié)果顯示，有活性的梅毒螺旋體刺激后HBMEC對HL-60細胞的趨化能力明顯增加，而滅活梅毒螺旋體并無該作用。前期研究發(fā)現(xiàn)，梅毒螺旋體膜蛋白Tpp47和Tpp17均可激活人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC），通過上調(diào)HUVEC中細胞間黏附分子和E選擇素的表達，增強HUVEC對單核巨噬細胞的趨化和黏附能力［14-15］。鑒于HBMEC與外周血管內(nèi)皮細胞存在較多理化性質(zhì)上的差異，梅毒螺旋體是否可以激活HBMEC從而誘導(dǎo)巨噬細胞趨化，有待進一步實驗驗證。

綜上所述，有活性的梅毒螺旋體可上調(diào)HBMEC中CXCL6、CXCL8和CXCL10的基因表達水平，提高CXCL6和CXCL8的分泌水平，同時增強HBMEC對HL-60細胞的趨化能力，這些可能在神經(jīng)梅毒的發(fā)病中起一定作用。本研究存在兩點不足，一方面，僅構(gòu)建了HBMEC的單層血腦屏障細胞模型，未考慮其他血腦屏障組成細胞和基底膜對HBMEC的影響；另一方面，未檢驗遷移來的HL-60細胞是否被激活，是否具有吞噬能力。后續(xù)研究中我們將構(gòu)建雙重或三重血腦屏障細胞模型，進一步探討遷移后的HL-60細胞對梅毒螺旋體的吞噬情況，以更全面和深入地分析HBMEC在神經(jīng)梅毒發(fā)病中的作用。