郭立蕓，謝鑫，梁云

(北京燕京啤酒股份有限公司，燕京啤酒釀造技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京，101300)

酵母絮凝是酵母細(xì)胞在多種因素影響下形成可逆的、無形聚集并可以再次擴(kuò)散到發(fā)酵介質(zhì)中的一種能力的體現(xiàn)。對(duì)于啤酒工業(yè)來說，酵母細(xì)胞的絮凝是相當(dāng)重要的。

STRATFORD[1]根據(jù)糖對(duì)酵母絮凝抑制的情況，區(qū)分酵母的2種絮凝表型，一種稱之為FLO1型，另一種為NewFLO型，這2個(gè)表型主要體現(xiàn)在糖抑制特征上，不同的糖類對(duì)于2種不同絮凝表型的酵母其抑制作用存在差別，F(xiàn)LO1型受FLO1、FLO5、FLO8等基因調(diào)控，NewFLO型受Lg-FLO1基因調(diào)控，F(xiàn)LO1型和NewFLO型酵母其絮凝性及其生理性狀存在較大差異(圖1)。

圖1 啤酒酵母的絮凝作用分類Fig.1 The classification of yeast flocculation

釀酒酵母攜有5個(gè)FLO家族絮凝基因[2-3]：FLO1、FLO5、FLO9、FLO10和FLO11。其中FLO1、FLO5、FLO9和FLO10功能是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞間的黏附，而FLO11使細(xì)胞與基質(zhì)產(chǎn)生黏附；另外的Lg-FLO1基因主要負(fù)責(zé)甘露糖、葡萄糖和麥芽糖敏感的NewFLO類型的啤酒酵母菌株絮凝(表1)。

表1 絮凝基因的基因功能Table 1 The function of flocculation gene

絮凝性是酵母細(xì)胞本身一種固有的特性，菌株遺傳背景的特異性起著決定性作用，其他各種因素作用都是通過影響絮凝基因的表達(dá)或者絮凝基因編碼蛋白的活性來影響酵母最終的絮凝性能。

熒光定量PCR是近年來發(fā)展起來的一項(xiàng)新技術(shù)，可用于目標(biāo)基因的表達(dá)、基因突變分析及多態(tài)性研究，是一種高效的基因表達(dá)量分析技術(shù)。該技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)施檢測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程。它可以從復(fù)雜的樣品中加測(cè)中微量的目標(biāo)核酸，具有高準(zhǔn)確性、高特異性[4-5]。張中保等[6]應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative， PCR)技術(shù),研究了玉米中10個(gè)水分脅迫誘導(dǎo)基因的相對(duì)表達(dá)量及表達(dá)模式，趙鮮仙[7]以釀酒酵母BY4742基因組DNA為模板, 采用PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得ADH7啟動(dòng)子、CYC1終止子以及MSN2編碼框序列, 采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)MSN2基因及其調(diào)控代表基因的轉(zhuǎn)錄變化水平。

目前針對(duì)于酵母絮凝性基因方面的研究并不深入，本研究在前期實(shí)驗(yàn)中篩選獲得1株弱絮凝性釀酒酵母，在此基礎(chǔ)上，通過糖抑制實(shí)驗(yàn)確定了弱絮凝性和對(duì)照酵母菌株的絮凝表型，采用分子生物學(xué)技術(shù)測(cè)定酵母絮凝基因，從分子層面確定，弱凝聚性釀酒酵母與對(duì)照菌株在基因?qū)用娴牟町愋?，確定酵母絮凝關(guān)鍵基因。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

弱凝聚性酵母菌株YJ085及對(duì)照菌株均由公司菌種保藏中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

13°P麥汁培養(yǎng)基(糖化車間生產(chǎn))、PDA培養(yǎng)基(北京陸橋)、YPD-Broth培養(yǎng)基(上海生工)。

1.1.3 主要試劑

糖類：甘露糖、麥芽糖、葡萄糖。

pH 3.9 50 mmol/L醋酸鈉-醋酸-0.1% CaCl2的絮凝緩沖液：稱取4.1 g醋酸鈉、3 g醋酸和1 g CaCl2溶解后定容至1 L，用醋酸調(diào)節(jié)pH為3.9。

PCR反應(yīng)相關(guān)試劑：Taq酶、dNTP、TaqReaction Buffer、Loading Buffer、QuantScript RT Kit、Real Master Mix(SYBR Green)(天根生化)；Goldview核酸染料；柱型酵母RNA提取試劑盒(上海生工)，RNAstore樣本保存液。

1.1.4 主要儀器

恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱(ZWY-C2112B型)，上海智城分析儀器制造有限公司；可見光分光光度計(jì)(WFJ2100型，Unico)；恒溫水浴鍋，美國polyscience；PCR儀(GeneAmp 9700 型)，美國Applied Biosystems公司；熒光定量PCR儀(Light cycler2.0型)，瑞士羅氏公司；水平電泳儀(DYY-8B型)，北京市六一儀器廠；凝膠成像系統(tǒng)(JY04S-3C型)，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；生化培養(yǎng)箱(INCUBATOR型)，日本SANYO公司；超凈工作臺(tái),蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.2 酵母絮凝表型的分型

1.2.1 酵母培養(yǎng)

挑取1環(huán)實(shí)驗(yàn)菌株，于25 ℃液體的麥汁培養(yǎng)基中活化1次，轉(zhuǎn)接至三角瓶中，25 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)48 h。

1.2.2 絮凝水平的測(cè)定

參照STRATFORD[1]、張博潤[8]、常玉廣等[9]采用的分光光度法：取48 h培養(yǎng)物離心收集菌體，用250 mmol/L溶液及無菌水各洗滌2次，60 ℃處理5 min以殺死細(xì)胞(為避免代謝旺盛的酵母細(xì)胞消耗糖而降低其濃度，該處理不影響細(xì)胞的絮凝)，然后測(cè)定絮凝水平離心收集菌體并懸于絮凝緩沖液中，立刻在600 nm處測(cè)OD值，然后細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至三角瓶中，25 ℃，120 r/min振蕩2 h至絮凝完成，室溫靜置30 min，取上清在600 nm 處測(cè)OD值。以振蕩處理后測(cè)定的OD值除以振蕩處理前的OD值，再乘以100%(即自由細(xì)胞濃度)表示絮凝水平。

1.2.3 酵母菌的絮凝表型分型

分別將不同濃度的甘露糖、麥芽糖、葡萄糖溶于絮凝緩沖液中，濃度分別為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mol/L，測(cè)定絮凝水平。

根據(jù)FLO1型酵母菌株絮凝僅受甘露糖抑制，而NewFLO型酵母菌株受多種糖抑制對(duì)酵母菌株進(jìn)行絮凝表型分型。

1.3 酵母絮凝表型基因型的測(cè)定

1.3.1 特異性引物設(shè)計(jì)

針對(duì)酵母絮凝基因FLO1、FLO5、FLO8、FLO9、FLO10、FLO11、Lg-FLO1設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)過查閱相關(guān)文獻(xiàn)，確定并設(shè)計(jì)引物見表2。

1.3.2 菌株培養(yǎng)

從原始瓊脂斜面挑取菌苔1環(huán)，使用10 mL 13 °P麥汁培養(yǎng)基活化培養(yǎng)48 h，吸取1 mL轉(zhuǎn)入10 mL 13 °P麥汁培養(yǎng)基活化培養(yǎng)24 h，挑取1環(huán)接種PDA培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)3 d。

1.3.3 酵母DNA的提取

酵母的DNA使用TIANGEN酵母基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，并使用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳(80 V，30 min)檢測(cè)所得DNA的質(zhì)量。

表2 酵母絮凝基因特異性引物Table 2 Specific primers of yeast flocculation gene

1.3.4 PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件

A:反應(yīng)體系的優(yōu)化

反應(yīng)體系：10×Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1μL，10 μmol/L上游引物1 μL，10 μmol/L下游引物1 μL，Taq酶0.5 μL，模板3 μL，ddH2O 38.5 μL。

反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。

1.3.5 酵母絮凝基因分型

對(duì)酵母的絮凝基因FLO1、FLO5、FLO8、FLO9、FLO10、FLO11、Lg-FLO1進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，若目的基因擴(kuò)增出現(xiàn)陽性條帶，則代表酵母具有該基因，若無目的基因條帶，則代表酵母不具有該基因。

1.4 酵母絮凝基因表達(dá)量分析

1.4.1 特異性引物設(shè)計(jì)

針對(duì)酵母絮凝基因FLO1、FLO5、FLO8、FLO9、FLO10、FLO11、Lg-FLO1設(shè)計(jì)特異性引物，并以ACT1管家基因作為內(nèi)參基因，引物序列見表2。

1.4.2 菌株培養(yǎng)

將酵母菌用接種針從原始瓊脂斜面無菌挑取菌苔1環(huán)到10 mL YPD-Broth培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)24 h；用移液管無菌移取1 mL菌液到10 mL YPD-Broth培養(yǎng)基中，25 ℃恒溫培養(yǎng)24 h；將試管中的10 mL菌液全部轉(zhuǎn)移到裝有90 mL YPD-Broth的250 mL三角瓶中，25 ℃恒溫培養(yǎng)，在固定時(shí)間段取發(fā)酵液1 mL，先離心收集菌體，用PBS緩沖液洗1次，再用100 μL PBS緩沖液懸浮細(xì)胞，加入2倍體積的RNAstore保存于4 ℃，待測(cè)。

1.4.3 酵母RNA提取

使用柱式酵母RNA提取試劑盒(上海生工)進(jìn)行提取，得到的產(chǎn)物使用0.8%的瓊脂糖進(jìn)行凝膠電泳(120 V，20 min)檢測(cè)是否成功提取RNA。

1.4.4 絮凝基因表達(dá)量分析

使用相對(duì)定量熒光PCR的方法進(jìn)行分析，使用QuantScript RT Kit進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄，使用Real Master Mix(SYBR Green)進(jìn)行熒光定量PCR分析。

逆轉(zhuǎn)錄體系：10×RT Mix 2 μL，Super pure dNTPs 2 μL，Random(10 μmol/L) 2 μL，Quant Reverse Transcriptase 1 μL，模板RNA 50 ng-2 μg，RNase-Free水補(bǔ)充至20 μL。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37 ℃孵育60 min。

熒光定量PCR反應(yīng)體系：2.5×Real Master Mix(添加20×SYBR溶液)9 μL，10μmol/L正向引物 0.5 μL，10 μmol/L反向引物0.5 μL，DNA模板10～100 ng，ddH2O 補(bǔ)充至20 μL。

熒光定量PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s(結(jié)束采集熒光信號(hào))，68 ℃ 30 s，45個(gè)循環(huán)。

按照反應(yīng)體系及條件對(duì)各絮凝基因與內(nèi)參基因進(jìn)行熒光定量PCR，使用所得Cp值換算比率，根據(jù)比率的大小即可得出基因表達(dá)量變化的差異，按公式(1)計(jì)算：

比率=2-ΔΔCp

(1)

(ΔCp=Cp目的基因-Cp內(nèi)參基因，ΔΔCp=ΔCp目的時(shí)間點(diǎn)-ΔCp對(duì)照時(shí)間點(diǎn)，用于生長過程中絮凝基因的表達(dá)變化分析)

根據(jù)得出的比率值，得知酵母絮凝基因的表達(dá)量差異，比率越高說明表達(dá)量越高，比率越低說明表達(dá)量越低。

1.4.5 酵母生長過程中的絮凝基因表達(dá)量變化

考察篩選菌株與對(duì)照菌株在發(fā)酵過程(YPD-Broth)中的基因表達(dá)量變化，每6 h取樣1次(搖勻)，進(jìn)行熒光定量PCR分析絮凝基因表達(dá)量，同時(shí)跟蹤各時(shí)間點(diǎn)的酵母數(shù)、出芽率、死亡率。

2 結(jié)果與討論

2.1 酵母絮凝表型分型實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 甘露糖對(duì)酵母菌株絮凝性的影響

在0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L不同濃度的甘露糖作用下，對(duì)篩選菌株YJ085及對(duì)照菌株進(jìn)行絮凝水平的測(cè)定，其絮凝性見圖2。

圖2 甘露糖對(duì)酵母菌株絮凝性的影響Fig.2 The effect of mannose on the flocculation of yeast strains

由圖2可知，YJ085菌株在0.2 mol/L甘露糖作用下，其絮凝抑制率達(dá)到50%左右，隨著糖濃度的增加，其絮凝抑制作用略有增加。對(duì)照菌株在0.2 mol/L低濃度甘露糖作用下，其絮凝抑制率約為80%，濃度為0.6 mol/L時(shí)，對(duì)照菌株基本完全抑制絮凝，甘露糖對(duì)弱凝聚性酵母菌株YJ085的絮凝抑制性要低于對(duì)照酵母菌株。

2.1.2 麥芽糖對(duì)酵母菌株絮凝性的影響

在0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L不同濃度的麥芽糖作用下，對(duì)篩選菌株YJ085及對(duì)照菌株進(jìn)行絮凝水平的測(cè)定，其絮凝性見圖3。

圖3 麥芽糖對(duì)酵母菌株絮凝性的影響Fig.3 The effect of maltose on the flocculation of yeast strains

由圖3可知，YJ085與對(duì)照菌株在麥芽糖濃度僅為0.2 mol/L時(shí)，絮凝抑制率高達(dá)到80%左右，隨著糖濃度的增加，絮凝抑制率基本保持在該水平。與對(duì)照酵母菌株相比，麥芽糖對(duì)弱凝聚性酵母菌株YJ085的絮凝抑制無顯著差異。

2.1.3 葡萄糖對(duì)酵母菌株絮凝性的影響

在0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L不同濃度的葡萄糖作用下，對(duì)篩選菌株YJ085及對(duì)照菌株進(jìn)行絮凝水平的測(cè)定，其絮凝性見圖4。

圖4 葡萄糖對(duì)酵母菌株絮凝性的影響Fig.4 The effect of glucose on the flocculation of yeast strains

由圖4可知，YJ085與對(duì)照菌株在葡萄糖濃度僅為0.2 mol/L時(shí)，絮凝抑制率達(dá)80%左右，隨著糖濃度的增加，基本維持在該水平。與對(duì)照菌株相比，葡萄糖對(duì)弱凝聚性酵母菌株YJ085的絮凝抑制要高于對(duì)照酵母菌株。

雖然從絮凝表型上可分為2類，但不同糖類對(duì)酵母菌株絮凝抑制效果不同，具體分析結(jié)果見表3。

表3 酵母菌株的分型Table 3 The flocculation phenotype of yeast strains

按照根據(jù)FLO1型酵母菌株絮凝僅受甘露糖抑制，而NewFLO型酵母菌株受多種糖抑制對(duì)酵母菌株進(jìn)行絮凝表型分型。YJ085與對(duì)照菌株均為不僅受甘露糖抑制，還受麥芽糖、葡萄糖的抑制，絮凝表型均為NewFLO型。

與對(duì)照相比，弱凝聚性酵母YJ085在甘露糖作用下絮凝性抑制低于對(duì)照酵母菌株。

2.2 酵母絮凝表型基因型的測(cè)定

對(duì)篩選獲得的凝聚性釀酒酵母菌株YJ085與對(duì)照菌株進(jìn)行絮凝基因分型，驗(yàn)證其絮凝表型的同時(shí)確定各絮凝基因的基因型見圖5和圖6。

從電泳圖可以看出，篩選弱凝聚性菌株YJ085與對(duì)照菌株絮凝基因存在狀況均一致，YJ085和對(duì)照酵母菌株中菌存在FLO1、FLO5、FLO8、FLO9、FLO11、Lg-FLO1基因，菌株的FLO10基因均不存在，均為NewFLO型。

圖5 對(duì)照菌株絮凝基因分型Fig.5 The flocculation genotype of the control strain

圖6 弱凝聚性酵母菌株YJ085基因分型Fig.6 The flocculation genotype of the YJ085 strain

2.3 酵母絮凝基因表達(dá)量分析

2.3.1 篩選菌株在生長過程中絮凝基因表達(dá)量的變化

以篩選菌株YJ085為研究對(duì)象，考察其在發(fā)酵過程(YPD-Broth)中的基因表達(dá)量變化，同時(shí)測(cè)定對(duì)照菌株基因表達(dá)量進(jìn)行比較，每6 h，搖勻取樣，進(jìn)行熒光定量PCR分析絮凝基因表達(dá)量，同時(shí)跟蹤各時(shí)間點(diǎn)的酵母數(shù)、出芽率、死亡率。在0～72 h發(fā)酵過程中，篩選菌株YJ085及對(duì)照菌株均在24 h達(dá)到高峰期，隨后呈小幅下降直至基本穩(wěn)定的趨勢(shì)，出芽率均由發(fā)酵初期的13%～18%至發(fā)酵后期穩(wěn)定在8%左右，死亡率在發(fā)酵過程中均維持在2%左右，生長曲線見圖7。

表4 酵母菌株絮凝基因分型Table 4 The flocculation genotype of the yeast strains

圖7 篩選菌株YJ085的生長曲線Fig.7 The growth curve of YJ085 strain

對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的發(fā)酵液取樣，提取酵母RNA進(jìn)行熒光定量PCR分析,篩選菌株YJ085與對(duì)照菌株在生長過程中絮凝基因的表達(dá)量變化見圖8。

圖8 菌株生長過程中絮凝基因的表達(dá)量變化Fig.8 The expression of flocculation gene in the growth of strain

從圖8可以看出，篩選菌株YJ085各絮凝基因表達(dá)量顯著低于對(duì)照菌株，篩選菌株YJ085的絮凝主要受FLO絮凝基因家族中的FLO5及Lg-FLO1基因調(diào)控，F(xiàn)LO1、FLO11表達(dá)量在發(fā)酵過程始終維持在較低表達(dá)量，F(xiàn)LO10基因不表達(dá)；在接種初期隨著酵母的大量繁殖，F(xiàn)LO家族絮凝基因(FLO5、FLO8、FLO9、FLO11)表達(dá)出現(xiàn)抑制，隨著酵母數(shù)在24 h左右達(dá)到高峰期，絮凝基因FLO5、FLO8、FLO9及Lg-FLO1表達(dá)量達(dá)到峰值；隨后酵母數(shù)開始下降，絮凝基因的表達(dá)量也出現(xiàn)大幅下降；至36 h左右酵母數(shù)基本穩(wěn)定，F(xiàn)LO8、FLO9基因開始維持在較低表達(dá)量，并呈現(xiàn)小幅波動(dòng)趨勢(shì)，而FLO5基因的表達(dá)量則呈現(xiàn)較大波動(dòng)，并在42 h及54 h左右出現(xiàn)峰值，F(xiàn)LO11基因發(fā)酵后期表達(dá)量有小幅上漲趨勢(shì)，Lg-FLO1基因表達(dá)量在48 h出現(xiàn)小幅升高后便穩(wěn)定在較低水平。表明無論是篩選菌株或?qū)φ站辏谙旅娼湍傅陌l(fā)酵過程中，絮凝基因的表達(dá)量與酵母增殖數(shù)量呈負(fù)相關(guān)。

2.3.2 酵母菌株絮凝基因的表達(dá)量差異

熒光定量PCR分析篩選菌株YJ085與對(duì)照菌株在發(fā)酵過程酵母增值高峰期(24 h)的絮凝基因表達(dá)量，分析結(jié)果見圖9。

圖9 不同酵母增殖高峰期的絮凝基因表達(dá)量Fig.9 The expression of flocculation gene in the proliferation peak of different yeast strains

經(jīng)絮凝基因表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，弱凝聚性釀酒酵母菌株YJ085絮凝基因FLO1、FLO5、FLO8、FLO10、FLO11、Lg-FLO1表達(dá)量均小于對(duì)照菌株，尤其是FLO5和Lg-FLO1絮凝基因表達(dá)量顯著低于對(duì)照菌株。與對(duì)照菌株相比，YJ085絮凝家族基因整體表達(dá)量降低了63.98%，絮凝基因表達(dá)量的下降導(dǎo)致其凝聚性變化，從基因?qū)用骊U述了弱凝聚性酵母絮凝水平低于對(duì)照菌株的分子機(jī)制。

3 結(jié)論

通過甘露糖、麥芽糖、葡萄糖作用，確定弱凝聚性釀酒酵母絮凝表型為NewFLO型，與對(duì)照菌株相比，受甘露糖絮凝抑制更為明顯。

通過PCR技術(shù)對(duì)篩選弱凝聚性酵母菌株和對(duì)照菌株的基因分型，確定YJ085和對(duì)照菌株中均存在FLO5、FLO8、FLO9、FLO11、Lg-FLO1基因，菌株的FLO10基因均不存在，均為NewFLO型。

基因表達(dá)分析方法——熒光定量PCR方法的測(cè)定結(jié)果表明，釀酒酵母發(fā)酵過程中，絮凝基因的表達(dá)量與酵母增殖數(shù)量呈負(fù)相關(guān)。通過對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的發(fā)酵液進(jìn)行取樣，提取酵母RNA分析得出YJ085與對(duì)照菌株在生長過程中絮凝基因的表達(dá)量變化主要受FLO絮凝基因家族中的FLO5及Lg-FLO1基因調(diào)控，F(xiàn)LO1、FLO11表達(dá)量在發(fā)酵過程始終維持在較低表達(dá)量，F(xiàn)LO10基因不表達(dá)，經(jīng)絮凝基因表達(dá)量分析發(fā)現(xiàn)，YJ085各絮凝基因表達(dá)量均小于對(duì)照菌株，絮凝基因表達(dá)量的變化導(dǎo)致其凝聚性變化，降低了63.98%，從基因?qū)用骊U述了菌株凝聚性弱的原因。

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