吳賢玲，喻喬，羅樹(shù)偉，黃啟江，謝舜

(湖南省計(jì)劃生育研究所，長(zhǎng)沙 410000)

男方因素導(dǎo)致的不育約占不育人群的30%～40%[1]，嚴(yán)重少弱精子癥患者精子密度<1～5×106/ml，高倍視野的精液參數(shù)呈現(xiàn)波動(dòng)[2]，有時(shí)甚至幾個(gè)高倍視野才發(fā)現(xiàn)1條活動(dòng)精子。這類患者在進(jìn)行輔助生殖技術(shù)時(shí)，我們要提前對(duì)其精子進(jìn)行冷凍，儲(chǔ)備一定數(shù)量的精子以滿足取卵日對(duì)精子的需求。常規(guī)精液冷凍對(duì)嚴(yán)重少弱精子癥患者應(yīng)用效果較差，且較難回收精子，隨著技術(shù)的發(fā)展，可以對(duì)嚴(yán)重少弱精子癥患者采取微量精子冷凍保存[2]，然后行微量精子凍融后卵胞漿內(nèi)單精子注射(ICSI)，但其臨床應(yīng)用效果如何目前還不太明確。本研究旨在對(duì)微量精子凍融后行ICSI的妊娠結(jié)局進(jìn)行分析，以期為嚴(yán)重少弱精子癥患者的臨床治療提供參考。

一、資料與方法

1. 研究對(duì)象及分組：回顧性分析2015年1月至2016年6月在本中心行輔助生殖技術(shù)助孕的嚴(yán)重少弱精子癥患者96例(100個(gè)治療周期)的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者經(jīng)至少3次精液常規(guī)分析檢查后診斷為嚴(yán)重少弱精子癥(精子濃度<1～5×106/ml)，排出精液高倍鏡下能夠找到活動(dòng)精子，精液體積大于1 ml；(2)所有患者均為男性因素不育；(3)無(wú)家族病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：夫妻雙方染色體檢查結(jié)果不正常者。

根據(jù)所用精子的不同進(jìn)行分組：43例患者(45個(gè)周期)使用凍融精子，即凍融精子組；53例患者(55個(gè)周期)使用新鮮精子，即新鮮精子組。

2.精液標(biāo)本的收集和處理：所有患者均于禁欲2～5 d后自慰方式取精，取精前排小便，清潔會(huì)陰，手淫法將精液完整收集到一次性無(wú)菌無(wú)毒的專用取精杯內(nèi)，標(biāo)本采集在本中心指定的取精室進(jìn)行。精液取出后立即置于37℃恒溫箱中液化15 min，加入精子分離上下層梯度介質(zhì)(Isolate，Irvine，美國(guó))洗滌精液1次，去上清后加入1 ml洗精受精液(G-IVF，Vitrolife，瑞典)進(jìn)行離心，離心1次后去上清，并保留少量液體于離心管中，輕輕晃動(dòng)離心管混勻精液后，取少量洗滌后的精液于顯微鏡下觀察都有活動(dòng)精子。凍融精子組對(duì)精子進(jìn)行微量冷凍，以1∶1比例加入已預(yù)溫的精子冷凍液混勻后冷凍；新鮮精子組則取少量沉淀置于離心管中等待ICSI使用。精液質(zhì)量評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)參考世界衛(wèi)生組織(WHO)《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》第五版[3]內(nèi)容。

3.促排卵方案：所有患者均采用標(biāo)準(zhǔn)黃體期短效長(zhǎng)方案，黃體中期開(kāi)始皮下注射曲普瑞林(達(dá)必佳，輝凌，德國(guó))0.1 mg/d，降調(diào)18 d，達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)后，予重組人卵泡刺激素(果納芬，默克雪蘭諾，瑞士)150～225 U/d和人絕經(jīng)期促性腺激素(樂(lè)得寶，珠海麗珠)75 U/d促排卵，當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≥18 mm時(shí)，于當(dāng)晚注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)5 000～10 000 U，34～36 h后常規(guī)超聲引導(dǎo)下行取卵術(shù)，于體視鏡下獲取卵冠丘復(fù)合物，將卵冠丘復(fù)合置于G-IVF受精液中培養(yǎng)。

4.精子微量冷凍及復(fù)蘇：雙人核對(duì)確認(rèn)后，將離心后的精液沉淀與精子冷凍液(Irvine，美國(guó))1∶1混勻，取少量混勻液放置于冷凍麥管上，在液氮上方停留數(shù)分鐘后投入液氮內(nèi)保存。解凍時(shí)，雙人核對(duì)確認(rèn)后，從液氮中取出冷凍的精液，置于37℃石蠟培養(yǎng)油(Vitrolife，瑞典)中快速?gòu)?fù)溫，準(zhǔn)備行ICSI操作。本研究?jī)鋈诰咏M微量精子凍融復(fù)蘇后均能找到活動(dòng)精子用于ICSI操作。

5. ICSI及妊娠判斷：HCG注射后39～40 h拆除顆粒細(xì)胞，選擇MⅡ期卵母細(xì)胞行ICSI操作。第1天觀察受精情況，第2天觀察胚胎卵裂情況，第3天觀察胚胎卵裂情況并進(jìn)行評(píng)分，評(píng)判出優(yōu)質(zhì)胚胎和可利用胚胎。優(yōu)質(zhì)胚胎評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：取卵后第1天(D1)觀察為雙原核(2PN)，D2無(wú)多核現(xiàn)象，D3的細(xì)胞數(shù)≥7細(xì)胞，細(xì)胞大小均一或略有不均，形狀基本規(guī)則，碎片≤20%。所有患者根據(jù)個(gè)人意愿及胚胎情況移植1～2枚胚胎，移植胚胎均達(dá)到胚胎評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)中的可用胚胎。

移植后12 d測(cè)晨尿并同時(shí)抽血，如HCG(+)則為生化妊娠，移植后28 d行B超檢查提示孕囊及心管搏動(dòng)者則為臨床妊娠。

二、結(jié)果

1. 兩組患者一般情況比較：兩組患者的女方年齡、不育年限、獲卵數(shù)、移植胚胎數(shù)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)(表1)。

2. 兩組患者臨床結(jié)局比較：兩組患者的受精率、優(yōu)胚率、可利用胚胎率、生化妊娠率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)(表2)。

表1 兩組患者一般情況比較(-±s)

表2 兩組患者臨床結(jié)局比較(%)

三、討論

有學(xué)者研究認(rèn)為，冷凍精子并不會(huì)影響小鼠的胚胎發(fā)育和表觀遺傳重組動(dòng)態(tài)進(jìn)程[4]。Di santo等[5]的研究表明，精子短暫接觸冷凍保護(hù)劑，凍存在液氮內(nèi)，可保存很長(zhǎng)時(shí)間，并且冷凍復(fù)蘇精子組的妊娠率和新鮮精子組對(duì)比無(wú)顯著差異，精子質(zhì)量不會(huì)隨時(shí)間推移而有明顯不良改變。Feldschuh等[6]報(bào)道使用冷凍28年的精子授精后成功出生了孩子。因此精子冷凍保存是一種安全有效的保存男性生育能力的方法。ICSI已作為常規(guī)技術(shù)應(yīng)用于輔助生殖領(lǐng)域，精液冷凍結(jié)合ICSI技術(shù)為少精子癥患者帶來(lái)了福音，且有研究證實(shí)精液的質(zhì)量和來(lái)源并不影響ICSI的受精及早期妊娠結(jié)局[7-8]。無(wú)精子癥和嚴(yán)重少弱精子癥等嚴(yán)重男性不育癥患者行ICSI助孕，其子代的出生缺陷情況與其他較好精子或正常精子行ICSI/IVF助孕的子代相比無(wú)明顯增加，Y染色體AZF基因檢測(cè)也沒(méi)有新增缺失位點(diǎn)和病例，這在一定程度上解除了為這些子代身心健康的擔(dān)憂[9]。

本中心采用的微量自精凍融方法，對(duì)于嚴(yán)重少弱精子癥精患者或者需多次冷凍才能儲(chǔ)備一定數(shù)量的精子以滿足取卵日需求的患者，有十分重要的意義。程序冷凍或非程序的緩慢冷凍是兩種傳統(tǒng)的精子冷凍保存方法，冷凍過(guò)程中經(jīng)歷的理化效應(yīng)直接作用于精子，造成DNA損傷、DNA碎片指數(shù)升高[10]，以及精子膜結(jié)構(gòu)不可逆的損傷等。對(duì)于中重度少弱精子癥患者而言，采用常規(guī)的冷凍方法會(huì)使極少量的精子暴露在大量高濃度的滲透性冷凍保護(hù)劑中，會(huì)加劇冷凍過(guò)程對(duì)精子的損傷作用，從而達(dá)不到良好的冷凍效果[11]。有研究表明，低活力的精子核DNA冷凍耐受性比高活力的精子差，其核DNA在冷凍過(guò)程中容易受損[12]。精子染色質(zhì)異?；駾NA受損均可導(dǎo)致受精失敗、胚胎發(fā)育異常、妊娠率降低[13]。有研究證實(shí)，快速冷凍不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量冰晶的形成，從而降低對(duì)精子的損傷[14]。本中心所使用的微量冷凍法，采用快速冷凍法，將精子在液氮上方停留5～8 min后投入液氮內(nèi)保存，這種方法的冷凍速率高于常規(guī)冷凍，雖稍低于直接投入液氮內(nèi)的冷凍方式，但其同時(shí)配合以麥管作為冷凍載體的小體積冷凍法還提高了冷凍速率。此外，嚴(yán)重少弱精子癥患者的精子數(shù)目少、活力弱，冷凍過(guò)程則進(jìn)一步降低精子的數(shù)目及活力，常規(guī)冷凍復(fù)蘇后精子活動(dòng)率及回收率低[15]。劉項(xiàng)等[16]對(duì)中重度少弱精子癥患者的凍融精子與新鮮精子的ICSI臨床結(jié)局進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)常規(guī)的冷凍方法其可利用胚胎率和優(yōu)胚率顯著低于新鮮對(duì)照組，提示常規(guī)冷凍方法可能并不適合嚴(yán)重少弱精子癥患者的精子冷凍。本中心采用的復(fù)溫是置于37℃液體中以達(dá)到快速?gòu)?fù)溫的目的，避免再生冰晶和脫?；?，能最大程度保證精子活動(dòng)率及回收率。目前在進(jìn)行ICSI操作時(shí)，ICSI皿中的精子滴我們采用的是回行滴，盡量選用游至相對(duì)干凈處的精子，在聚乙烯吡咯烷酮(PVP，Irvine，美國(guó))內(nèi)進(jìn)行清洗，防止將精子冷凍液帶入卵母細(xì)胞漿內(nèi)。本中心嚴(yán)重少弱精子癥凍融精子組與新鮮精子組的受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、可利用胚胎率、生化妊娠率、臨床妊娠率、流產(chǎn)率比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示微量精子冷凍并不影響少弱精子癥患者的妊娠結(jié)局。

但因?yàn)閲?yán)重少弱精子癥患者的病因各異，主要由遺傳因素和環(huán)境因素引起，在研究中應(yīng)考慮到染色體異常的因素，本研究中未進(jìn)行患者內(nèi)分泌激素水平檢查和染色體分析，可能對(duì)研究結(jié)果造成一定影響。后續(xù)研究應(yīng)進(jìn)一步完善實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入分析。

綜上所述，嚴(yán)重少弱精子癥患者微量精子凍融后行ICSI可以獲得與新鮮精子ICSI相似的妊娠結(jié)局，但仍需后續(xù)更大樣本量的前瞻性研究加以探討驗(yàn)證。

【參 考 文 獻(xiàn)】

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