黃志軍，王遙，崔國英，高藝璇，王飛，李長忠( 山東省立醫(yī)院，濟(jì)南25002；2 鄒城市人民醫(yī)院)

近年來宮頸癌的發(fā)病率逐年升高并呈年輕化趨勢。人乳頭瘤病毒(HPV)感染，特別是高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌最重要的致病因素，但其并不是惟一因素。約40%處于性活躍期女性至少感染過一種類型HPV，但僅有不到1%的女性因機(jī)體免疫系統(tǒng)無法清除HPV最終發(fā)展為宮頸癌。近年研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體免疫系統(tǒng)可能在其發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用[1～5]。人類白細(xì)胞抗原(HLA)是人類主要組織相容性復(fù)合體(MHC)的編碼基因，包括經(jīng)典的HLA-Ⅰ類分子與非經(jīng)典的HLA-Ⅰ類分子。HLA是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在機(jī)體抗原呈遞和免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。有研究表明，HLA完全缺失、等位基因丟失或基因特異性下調(diào)等對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展至關(guān)重要[6]。HLA-F屬于非經(jīng)典的HLA-Ⅰ類分子，在乳腺癌、T細(xì)胞淋巴瘤等多種腫瘤組織中異常表達(dá)[8]。但鮮見其在宮頸癌組織表達(dá)的報道。本研究觀察了宮頸癌組織HLA-F表達(dá)變化，并分析其與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，探討HLA-F在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2012年1月～2016年6月山東省立醫(yī)院收治的宮頸癌患者115例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①宮頸癌診斷符合《婦產(chǎn)科學(xué)》(第7版)中的診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確為宮頸鱗癌或腺癌；②采用廣泛性子宮切除+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)治療；③初次治療，術(shù)前未行任何抗腫瘤治療；④無其他原發(fā)惡性腫瘤史或自身免疫性疾??；⑤臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并嚴(yán)重的心、肝、腎等重要臟器疾病，以及自身免疫性疾病或其他部位惡性腫瘤者；②臨床病理資料不完整者；③術(shù)前接受過任何抗腫瘤治療者?；颊吣挲g23～75(44.53±7.65)歲，其中≤45歲 62例、>45歲 53例；組織學(xué)類型：鱗癌87例，腺癌28例；組織分化程度：高中分化29例，低未分化86例；臨床分期(參照國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟2009年分期標(biāo)準(zhǔn))：Ⅰ期76例，Ⅱ期39例；腫瘤直徑：≥4 cm 46例，<4 cm 69例；浸潤深度：≤1/2肌層45例，>1/2肌層70例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移30例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移85例。本研究通過山東省立醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者或其家屬均知情同意。

1.2 宮頸癌組織及其配對的癌旁正常組織HLA-F表達(dá)檢測 采用免疫組化法。取手術(shù)切除的宮頸癌組織115例份及其配對的癌旁正常組織20例份，多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm厚連續(xù)切片。將切片置于烤片機(jī)上65 ℃烘烤90 min，依次經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，蒸餾水沖洗5 min×3次，PBS浸泡5 min；然后置于檸檬酸鹽修復(fù)液中，采用高壓煮沸法進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫；PBS洗滌5 min×3次，37 ℃ 3% H2O2孵育30 min，滅活內(nèi)源性過氧物酶；PBS洗滌5 min×3次，滴加兔抗人HLA-F單克隆抗體(1：200)，4 ℃冰箱孵育過夜；次日37 ℃孵育30 min，PBS洗滌5 min×3次，滴加聚合酶輔助劑，37 ℃孵育30 min；PBS洗滌5 min×3次，滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記抗兔IgG聚合物，37 ℃孵育30 min；PBS洗滌5 min×3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，自來水充分沖洗返藍(lán)，梯度乙醇脫水，自然晾干，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察。以PBS代替一抗作為陰性對照，以HLA-F蛋白陽性表達(dá)的脾臟組織作為陽性對照。由兩位有經(jīng)驗的病理科醫(yī)師采用雙盲法獨立閱片，結(jié)果不一致時協(xié)商解決。HLA-F陽性染色定位于細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒狀。應(yīng)用Leica IM50圖像采集系統(tǒng)，每張切片隨機(jī)選取4個200倍視野，采用H-score評分法[9]半定量分析HLA-F表達(dá)。H-score評分=∑Pi(I+1)，其中Pi表示染色強(qiáng)度不同的陽性細(xì)胞數(shù)量占該視野所有細(xì)胞總數(shù)的百分比，范圍為0～100%；I表示染色強(qiáng)度，分為4個評分等級：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。計算每張組織切片所取4個視野的H-score評分，其平均值為該切片最終的H-score評分。以H-score評分表示宮頸組織HLA-F表達(dá)。H-score評分越高，說明宮頸組織HLA-F表達(dá)越高。

1.3 宮頸癌組織HLA-F蛋白表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)關(guān)系的分析 比較不同年齡、組織學(xué)類型、組織分化程度等臨床病理參數(shù)的宮頸癌患者H-score評分。

2 結(jié)果

2.1 宮頸癌組織與癌旁正常組織HLA-F表達(dá)比較 宮頸癌組織HLA-F表達(dá)為(2.17±0.83)分，癌旁正常組織為(1.13±0.15)分，二者比較P<0.01。

2.2 宮頸癌組織HLA-F蛋白表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 宮頸癌組織HLA-F表達(dá)與患者組織學(xué)類型、腫瘤直徑以及浸潤深度有關(guān)(P均<0.05)，與患者年齡、組織分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況無關(guān)(P均>0.05)。見表1。

3 討論

臨床研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌患者通常存在免疫系統(tǒng)功能低下，機(jī)體抗腫瘤免疫監(jiān)控失靈可能在其發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。在機(jī)體抗腫瘤免疫中占據(jù)主導(dǎo)地位的是細(xì)胞免疫，在細(xì)胞免疫中參與免疫監(jiān)視的主要效應(yīng)細(xì)胞有樹突狀細(xì)胞、吞噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌前病變和宮頸癌病灶中樹突狀細(xì)胞數(shù)量明顯減少、自然殺傷細(xì)胞表面的激活性受體表達(dá)降低以及輔助性T細(xì)胞亞群失衡等[10～12]。提示機(jī)體免疫系統(tǒng)功能低下可能與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

表1 宮頸癌組織HLA-F表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(分，

HLA-F屬于非經(jīng)典的HLA-Ⅰ類分子，其編碼基因位于人類6號染色體短臂上，基因全長5.4 kb，由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成。由于成熟HLA-F mRNA缺乏外顯子7，其編碼的HLA-F蛋白質(zhì)尾區(qū)短于其他HLA-Ⅰ類分子[13]。Geraghty等[13]最早在B淋巴細(xì)胞、靜止的T細(xì)胞和皮膚癌組織內(nèi)檢測到HLA-F的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。Lee等[14]研究發(fā)現(xiàn)，盡管在膀胱、皮膚、肝臟等組織細(xì)胞內(nèi)檢測到HLA-F表達(dá)，但在正常機(jī)體中，大多數(shù)這類細(xì)胞的表面無HLA-F表達(dá)。用EB病毒轉(zhuǎn)染的B細(xì)胞和單核細(xì)胞表面均可檢測到HLA-F表達(dá)，即靜止期的免疫細(xì)胞表面缺乏HLA-F表達(dá)；而一旦機(jī)體免疫細(xì)胞被激活，所有胞內(nèi)表達(dá)HLA-F的細(xì)胞均能在細(xì)胞表面表達(dá)[15]。由此推測，HLA-F可作為機(jī)體免疫激活的標(biāo)志物之一。

研究發(fā)現(xiàn)，HLA-F的同源性分子HLA-E、HLA-G可參與腫瘤的免疫逃逸[8，16]。但HLA-F參與腫瘤免疫逃逸的相關(guān)研究較少。Harada等[17]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織HLA-F陽性表達(dá)與腫瘤大小有關(guān)，但與患者生存率無關(guān)。Ishigami等[18]研究發(fā)現(xiàn)，胃腺癌組織HLA-F陽性表達(dá)與腫瘤浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、淋巴管和血管侵犯有關(guān)。Zhang等[19]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織HLA-F陽性表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤浸潤深度以及腫瘤TNM分期均無關(guān)。Xu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織HLA-F陽性表達(dá)率明顯高于正常肝臟組織，且其表達(dá)變化與門靜脈癌栓、腫瘤數(shù)目及患者性別等有關(guān)。以上研究表明，HLA-F在腫瘤中的表達(dá)具有組織差異性，在不同腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮著不同作用。

Lepin等[21]研究發(fā)現(xiàn)，HLA-F四聚體可與免疫抑制性受體ILT-2、ILT-4結(jié)合，而淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等表面均表達(dá)ILTs，故HLA-F與ILTs結(jié)合可能抑制這些免疫細(xì)胞，從而在免疫反應(yīng)的不同時期產(chǎn)生免疫耐受作用。Goodrige等[22]研究發(fā)現(xiàn)，HLA-F分子與HLA-Ⅰ類分子的開放構(gòu)象可作為配體與自然殺傷細(xì)胞及T細(xì)胞表面的KIR3DL2結(jié)合；而在炎癥反應(yīng)微環(huán)境中，KIR3DL2、HLA-F與HLA-Ⅰ表達(dá)均上調(diào)，提示三者在炎癥反應(yīng)中可能具有免疫調(diào)節(jié)作用。HLA-F在腫瘤免疫耐受機(jī)制中的作用至今尚不清楚，其在宮頸癌致病機(jī)制中的作用亦鮮見報道。

本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織HLA-F表達(dá)明顯高于癌旁正常組織，與Xu等[20]的研究結(jié)果基本一致。本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，HLA-F表達(dá)與宮頸癌組織學(xué)類型、浸潤深度、腫瘤直徑有關(guān)，而與患者年齡、組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，與Harada等[17]報道基本一致。上述結(jié)果表明，HLA-F與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。

綜上所述，宮頸癌組織HLA-F表達(dá)升高，其表達(dá)變化與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。HLA-F可能通過誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受，從而在腫瘤免疫逃逸中發(fā)揮重要作用，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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