黃斌 劉素云 萬麗佳 劉明 吳小秧 羅勤

[摘要]目的 對(duì)熒光定量PCR法在人巨細(xì)胞病毒感染患兒不同時(shí)段尿標(biāo)本檢測(cè)巨細(xì)胞病毒中的應(yīng)用效果進(jìn)行探討。方法 選取2015年9月～2017年2月我院兒科收治的30例人巨細(xì)胞病毒感染患兒，所有患兒分別于清晨采集晨尿作為晨尿組，于其他時(shí)段采集尿液標(biāo)本作為隨機(jī)時(shí)段組，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)不同時(shí)段尿標(biāo)本人巨細(xì)胞病毒DNA水平進(jìn)行檢查，對(duì)比兩組陽(yáng)性檢出率。結(jié)果 晨尿組，27例檢出人巨細(xì)胞病毒陽(yáng)性，檢出率為90.00%，隨機(jī)時(shí)段組，20例檢出人巨細(xì)胞病毒陽(yáng)性，檢出率66.67%，晨尿組明顯高于隨機(jī)時(shí)段組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 對(duì)人巨細(xì)胞病毒感染患兒應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)巨細(xì)胞病毒，采集患兒晨尿作為檢測(cè)標(biāo)本，陽(yáng)性檢出率較高，可有效降低漏診情況，在臨床中值得推廣應(yīng)用。

[關(guān)鍵詞]人巨細(xì)胞病毒；小兒；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；不同時(shí)段

[中圖分類號(hào)] R446.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2018）4（c）-0119-03

Detection of cytomegalovirus in children with cytomegalovirus infection by urine samples at different time intervals

HUANG Bin LIU Su-yun WAN Li-jia LIU Ming WU Xiao-yang LUO Qin

Department of Pediatrics，People′s Hospital of Pingxiang City，Jiangxi Province，Pingxiang 337000，China

[Abstract]Objective To investigate the effect of fluorescent quantitative PCR in detection of cytomegalovirus （HCMV） in urine samples of children with HCMV infection at different time intervals.Methods A total of 30 cases of infection in our hospital from September 2015 to February 2017 in Department of Pediatrics of infected children，for all children were collected in the morning urine as morning urine group，collecting urine specimens as random specimens from other time periods，the application of real-time fluorescence quantitative PCR technology in different periods of urine HCMV DNA level standard for examination，the positive detection rate was compared between the two groups.Results The results showed that morning urine group，27 cases were detected HCMV positive，the detection rate of 90.00%，random time urine group，20 cases were detected HCMV positive，the detection rate of 66.67%，compared the two groups，morning urine group was significantly higher than that of random time group，the difference was statistically significant （P<0.05）.Conclusion The detection of HCMV real-time fluorescent quantitative PCR in children with infection of HCMV in children，collection of morning urine samples for testing，the positive rate is high，effectively reduce the misdiagnosis，it is worth in clinical application.

[Key words]Human cytomegalovirus；Children；Real-time quantitative PCR；Different periods

巨細(xì)胞病毒感染是由人巨細(xì)胞病毒（human cytom-egalovirus，HCMV）引起的人類感染性疾病。HCMV一旦侵入體內(nèi)，將長(zhǎng)期或終身存在體內(nèi)，在絕大多數(shù)免疫正常個(gè)體，常成無癥狀感染，但在免疫抑制個(gè)體，新生兒及嬰幼兒可出現(xiàn)明顯病癥，表現(xiàn)為肝炎、肺炎、腦膜腦炎、智力低下和先天性耳聾等。HCMV可從宿主尿液、血液及呼吸道分泌物等多個(gè)部位排出，國(guó)內(nèi)外已廣泛進(jìn)行血尿痰等不同標(biāo)本的檢測(cè)[1-2]，尿液標(biāo)本因其陽(yáng)性率較高[3]、無創(chuàng)傷，易為患兒及家屬所接受。目前國(guó)內(nèi)外已有晨尿標(biāo)本檢測(cè)HCMV-DNA水平的相關(guān)報(bào)道[4]，但新生兒及嬰幼兒因其排尿控制較困難，有時(shí)需采集其他時(shí)段隨機(jī)尿標(biāo)本。本研究通過對(duì)不同時(shí)段尿應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)HCMV-DNA水平，比較晨尿與隨機(jī)時(shí)段尿的HCMV陽(yáng)性檢出率，現(xiàn)報(bào)道如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2015年9月～2017年2月我院兒科收治的30例HCMV感染患兒，其中，男16例，女14例；年齡34 h～1歲，平均（6.5±2.7）個(gè)月。所有患兒分別于清晨采集晨尿作為晨尿組，于其他時(shí)段采集尿液作為隨機(jī)時(shí)段組。所有患兒均符合《巨細(xì)胞病毒感染診斷方案》中診斷標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒家屬對(duì)本研究知情，且簽署知情同意書。其中下呼吸道感染25例，高膽紅素血癥2例，腸炎3例，部分病例病程較長(zhǎng)。

1.2方法

標(biāo)本采集：晨尿組患兒于清晨6時(shí)采集患兒晨尿，隨機(jī)時(shí)段尿組患兒當(dāng)天任意時(shí)間內(nèi)采集患兒尿標(biāo)本。儀器試劑：采用ABI7300型熒光定量PCR儀（美國(guó)）檢測(cè)HCMV，核酸擴(kuò)增熒光定量檢測(cè)試劑盒（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）。檢測(cè)方法：將采集到的尿液標(biāo)本輕輕顛倒搖勻，用加樣槍吸出100 μl，取離心管，裝入DNA濃縮液100 μl，將吸出的尿液標(biāo)本一并加入，振蕩搖勻，在離心機(jī)上按12000 r速率離心10 min，將上清液去除，將DNA提取液20 μl加入到剩余的沉淀物中打勻，然后進(jìn)行瞬時(shí)離心數(shù)秒，在100℃條件下保溫10 min，再行12000 r速率離心5 min，然后取出2 μl上清液做PCR擴(kuò)增。

1.3判斷標(biāo)準(zhǔn)

陽(yáng)性：HCMV-DNA呈典型S型增長(zhǎng)曲線，試驗(yàn)定量結(jié)果>500 copies/ml；陰性：不符合陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)即為陰性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

通過對(duì)不同時(shí)段患兒尿采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)，結(jié)果顯示，晨尿組，陽(yáng)性檢出率為90.00%，隨機(jī)時(shí)段組，陽(yáng)性檢出率為66.67%，兩組比較，晨尿組陽(yáng)性檢出率明顯高于隨機(jī)時(shí)段組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（表1）。

表1 兩組患兒陽(yáng)性檢出結(jié)果的比較

3討論

HCMV感染是由HCMV引起的人類感染性疾病。我國(guó)是HCMV感染的高發(fā)區(qū)，平均感染率高達(dá)80%～90%[5]。HCMV一旦侵入體內(nèi)，將長(zhǎng)期或終身存在體內(nèi)，在絕大多數(shù)免疫正常個(gè)體，常成無癥狀感染，但在免疫抑制個(gè)體，新生兒及嬰幼兒可出現(xiàn)明顯病癥，表現(xiàn)為肝炎、肺炎、腦膜腦炎、智力低下和先天性耳聾等。HCMV可從宿主尿液、血液及呼吸道分泌物等多個(gè)部位排出，國(guó)內(nèi)外已廣泛進(jìn)行血尿痰等不同標(biāo)本的檢測(cè)，尿液標(biāo)本因其陽(yáng)性率較高、無創(chuàng)傷，易為患兒及家屬所接受。

HCMV屬雙鏈DNA病毒，僅在人和人間傳播，具有高度的種屬特異性，其生物學(xué)特征表現(xiàn)為潛伏-活化，嬰幼兒活動(dòng)性HCMV感染會(huì)造成終末器官病變，以肝炎肺炎等為主要表現(xiàn)形式，在對(duì)患兒治療時(shí)，及早對(duì)小兒HCMV感染準(zhǔn)確、快速、便捷的診斷，能為臨床治療提供可靠的依據(jù)[6]?，F(xiàn)階段，HCMV感染診斷中，主要依靠實(shí)驗(yàn)室檢查，包含血清特異性抗體檢測(cè)、病毒培養(yǎng)、抗原血癥檢測(cè)、DNA的PCR檢測(cè)、組織病理學(xué)檢測(cè)及CMV-RNA檢測(cè)等。而現(xiàn)階段比較推崇的檢測(cè)方法為CMV-DNA定量檢測(cè)，通過對(duì)熒光信號(hào)積累，對(duì)PCR進(jìn)程實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)定量分析的目的。而在對(duì)不同標(biāo)本檢測(cè)時(shí)，標(biāo)本的采集時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果也會(huì)帶來較大的影響。

尿液檢查是當(dāng)前臨床檢查中重要的檢查項(xiàng)目之一，應(yīng)用范圍非常廣泛，有利于醫(yī)生對(duì)疾病進(jìn)行判斷，掌握患者的病情，并且作為檢測(cè)的標(biāo)本，尿液取材更加方便，PCR定量檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確，在HCMV感染動(dòng)態(tài)觀察中，以尿液作為檢驗(yàn)標(biāo)本應(yīng)用效果更好[8]。為了使尿檢有效性得到提高，全自動(dòng)尿沉渣分析儀在尿檢中的應(yīng)用越來越多，有效提高了尿檢速度的同時(shí)，尿檢效率也得到提高。而影響尿檢結(jié)果準(zhǔn)確性的因素有很多，包含尿液采集時(shí)間、檢驗(yàn)時(shí)間及容器污染等因素，都會(huì)導(dǎo)致檢驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)差異[9-10]。本研究結(jié)果顯示，晨尿組陽(yáng)性檢出率達(dá)到90.00%，而隨機(jī)時(shí)段組陽(yáng)性檢出率僅為66.67%，提示尿液標(biāo)本采集時(shí)間段的不同，對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響非常大。之所以選擇晨尿，即清晨起床后空腹?fàn)顟B(tài)下首次排除的尿液，究其原因，主要是由于人在經(jīng)過一夜的睡眠后，清晨首次晨尿在人體內(nèi)會(huì)經(jīng)過濃縮后發(fā)生酸化，在酸性環(huán)境中，尿液內(nèi)上皮細(xì)胞、血細(xì)胞及管型等有形成分更為穩(wěn)定；并且清晨尚未進(jìn)食，尿液成分不會(huì)受到飲食的影響，保證了化學(xué)成分測(cè)定的準(zhǔn)確性[11-12]；反之，采集隨機(jī)時(shí)段尿液標(biāo)本時(shí)，患兒隨時(shí)排尿使得體內(nèi)尿液不會(huì)聚集發(fā)生酸化，并且經(jīng)過運(yùn)動(dòng)、飲食等因素的影響，尿液中各種檢測(cè)指標(biāo)也變得分散、稀釋，反映在檢驗(yàn)結(jié)果中，就會(huì)出現(xiàn)結(jié)果準(zhǔn)確性下降的情況，如餐后尿，因此時(shí)機(jī)體的代謝比較旺盛，腎血流量增大，白細(xì)胞邊緣池進(jìn)入循環(huán)池，病理成分也有所增加[13-14]。所以尿液中的細(xì)胞含量相對(duì)較高，由于隨機(jī)尿不受時(shí)間的限制，所以在急診與門診患兒尿液篩查中更為適合，標(biāo)本也比較新鮮，容易獲取，但所采集的尿液標(biāo)本只能對(duì)一段時(shí)間內(nèi)患者機(jī)體的情況進(jìn)行反映，容易受多種因素的影響，導(dǎo)致病理臨界物質(zhì)濃度降低，出現(xiàn)漏診情況[15]。也有研究認(rèn)為，晨尿在膀胱內(nèi)存留的時(shí)間過程，尿液中的葡萄糖及硝酸鹽等成分容易被分解，對(duì)在酸性環(huán)境中容易改變的物質(zhì)不易被檢測(cè)出來，所以認(rèn)為采集清晨第2次晨尿作為尿液標(biāo)準(zhǔn)來檢測(cè)更加準(zhǔn)確[9]。因此在多種尿檢項(xiàng)目中都要求采集患者晨尿作為標(biāo)本來檢驗(yàn)。

綜上所述，對(duì)HCMV感染患兒用熒光定量PCR法檢測(cè)，不同時(shí)段尿液標(biāo)本對(duì)檢測(cè)結(jié)果會(huì)帶來極大的影響，隨機(jī)時(shí)段尿液標(biāo)本由于有形成分含量低，因此檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性不高；而晨尿因其保留了被檢測(cè)成分物質(zhì)的含量及形態(tài)，所以陽(yáng)性檢出率更高，檢測(cè)結(jié)果更準(zhǔn)確，在小兒HCMV檢測(cè)中應(yīng)用效果較好，在臨床中有推廣應(yīng)用的價(jià)值。

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（收稿日期：2017-11-07 本文編輯：崔建中）