王金耀，黨換梅

（1山西農(nóng)業(yè)大學園藝學院，山西太谷 030801；2山西省設施蔬菜提質(zhì)增效協(xié)同創(chuàng)新中心）

萱草屬（Hemerocallis spp.）植物是百合科多年生宿根草本，多數(shù)分布于亞洲溫帶至亞熱帶地區(qū)，不僅具有觀賞價值，還具有較高食用價值[l,2]。萱草屬植物以其特有的觀花、食用、藥用等功能引起國內(nèi)外研究人員的重視，科學家們針對萱草屬植物的資源分布、繁殖育種、栽培應用以及推廣等方面做了多方面研究[3]，隨著人們對萱草屬植物的深入研究，以及實際生活中食用萱草屬植物過稱中引發(fā)的中毒現(xiàn)象[4,5]，進一步揭示了萱草屬植物中含有秋水仙堿。汪乃興、趙濱等以水為提取劑，利用差示脈沖極譜法在花蕾中檢測到秋水仙堿[6]。劉陳力為等在黃花菜中提取得到秋水仙堿[7]。

萱草屬植物因其含有秋水仙堿而造成鮮食時容易中毒，甚至危害生命。因此，針對萱草屬植物的蔬菜學評價中，秋水仙堿含量的高低直接影響其營養(yǎng)品質(zhì)的優(yōu)劣。本研究利用高效液相色譜法（HPLC）測定了2012年前后收集到的17份萱草屬植物中秋水仙堿含量，以期為萱草屬植物蔬菜學評價體系的建立提供依據(jù)。

表1 供試材料引種信息

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗供試材料取自山西農(nóng)業(yè)大學萱草種質(zhì)資源圃（見表1），花期采收完整花蕾，45℃烘干，打磨成粉備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準溶液配制。準確稱取秋水仙堿標準品20mg（純度98%），加入1mL色譜級甲醇配制成20mg/mL的儲備液，使用時吸取少量進行稀釋。

1.2.2 色譜條件的確定。依據(jù)臺海川[8]采用RP-HPLC法建立秋水仙堿含量的測定體系（Waters C18（150mm×4.6mm，5um）、流動相比例甲醇∶水=44∶56、流速 1 mL/min、柱溫 25℃、進樣量20μL），對秋水仙堿的測定波長進行選擇與確定。在190～600nm波長范圍內(nèi)進行紫外掃描，確定其最佳檢測波長。

1.2.3 樣品檢測。秋水仙堿提取采用超聲波提取法，含量測定采用高效液相色譜法[9]。參考課題組張寧建立的體系制備秋水仙堿待測樣[10]，利用Thermo Fisher U3000 HPLC高效液相色譜系統(tǒng)對樣品進行檢測。

2 結果與分析

2.1 優(yōu)化色譜測定條件

2.1.1 最優(yōu)檢測波長檢測波長的確定。利用HPLC對5μg/mL的秋水仙堿標樣在設定波長范圍內(nèi)（190～600nm）進行3D掃描，結果發(fā)現(xiàn)該標準樣品在243nm與350nm有最大吸收（見圖1）。5μg/mL秋水仙堿圖1標準樣的HPLC圖譜（243nm和350nm）標準溶液在243nm與350nm處的出峰時間分別為4.933min與4.923min，243nm處的峰高和峰面積分別為4.510和1.726，而350nm處的峰高和峰面積分別2.370和0.868，相比較可知，秋水仙堿在243nm處的靈敏度高。

進一步分析色譜峰的峰型可以看出，標準溶液在243nm處檢測的所需組分（圖1中的組分5）峰前有1個小峰（組分4）干擾，而在350 nm處檢測出的秋水仙堿組分峰前沒有小峰干擾。為了避免干擾，減少誤差，提高試驗方法與結果的準確性，本研究選定350nm為秋水仙堿的檢測波長。

圖1 秋水仙堿標準樣的HPLC圖譜

2.1.2 線性回歸關系線性關系考察。吸取少量儲備液，配制 0.1、0.2、0.3、0.4和0.5μg/mL的秋水仙堿標準梯度溶液，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得到秋水仙堿標準系列溶液的回歸曲線（見圖2），回歸方程為 Y=0.7939X-0.0218，R2=0.999。

圖2 秋水仙堿的標準曲線圖

圖3 標準溶液與供試樣品的高效液相色譜圖

2.1.3 樣品測定。利用高效液相色譜法對秋水仙堿標準液和‘野生黃花1號’花蕾提取液進行測定（見圖3）。由圖3可知，標樣中秋水仙堿峰的出峰時間為4.920min，而在試樣中的出峰時間受到前后組分的影響而出峰時間提前為4.797min，但滿足出峰時間前后相差在5%的范圍。為進一步對秋水仙堿組分進行確定，在供試樣品提取過程中，加入一定量的標準品溶液，對比保留時間是否出現(xiàn)差異。結果發(fā)現(xiàn)，在試樣中加入一定濃度的秋水仙堿標準品，試樣仍然在同一時間（4.794min）出峰，但是信號值明顯提高，故可以確定試樣中的組分1和標樣中的組分1同為秋水仙堿。

2.2 系統(tǒng)適應性試驗

2.2.1 精密度試驗。取20μL的0.5μg/mL秋水仙堿標準溶液和‘金娃娃1號’溶液試樣連續(xù)進樣7次，測定秋水仙堿含量的相對標準差分別為0.53%和1.23%，表明儀器進樣的精密度能夠達到實驗要求。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗。取20μL的0.5μg/mL秋水仙堿標準溶液和‘金娃娃1號’試樣溶液分別在0h、2h、4h、6h進樣測定，標樣與試樣中秋水仙堿含量的相對標準差分別為2.78%和3.35%；進一步取20μL的0.5μg/m秋水仙堿標準溶液和試樣（‘金娃娃1號’）溶液分別在0、1、2、3d進樣測定，標樣相對標準差為2.96%，試樣相對標準差為3.23%。結果表明，秋水仙堿含量在3d內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3 可行性分析。取20μL的0.5μg/m秋水仙堿標準溶液和‘金娃娃1號’試樣溶液分別在45℃保溫箱與4℃冰箱中放置0d、2d、4d、8d進樣測定，標樣的相對標準差為2.87%，試樣的相對標準差為3.79%。結果表明標樣與試樣中的秋水仙堿含量溫度穩(wěn)定性良好。

2.3 不同萱草屬植物中秋水仙堿含量比較

由表2可知，17份萱草屬植物花蕾中只有9種萱草屬植物中檢測出秋水仙堿，其余8種萱草屬植物花蕾中未檢測出秋水仙堿。萱草屬植物花蕾中秋水仙堿含量最高的是‘野生黃花1號’，為0.218μg/g，其次是‘北黃花’，為0.204μg/g?！秉S花’中秋水仙堿含量與‘東莊黃花’和‘沖里花1號’中秋水仙堿含量存在顯著差異，后兩者分別為0.187μg/g和0.184μg/g；這兩者又與‘金娃娃 1 號’、‘大荔黃花’、‘長嘴子花 1 號’、‘茄子花1號’和‘茶子花’花蕾中秋水仙堿含量存在顯著差 異 ， 其 含 量 分 別 為 0.162μg/g、0.166μg/g、0.156μg/g、0.158μg/g和 0.164μg/g。而在其它 8 份材料中均未檢測出秋水仙堿。

2.4 秋水仙堿含量與花色的相關性分析

由表3可知，17份萱草屬植物材料中的秋水仙堿含量與花色的相關系數(shù)為-0.894，9種黃花材料的花蕾中均檢測到秋水仙堿，其余8種紅花材料的花蕾中均未檢測到秋水仙堿。

3 結論與討論

萱草屬植物花蕾中秋水仙堿HPLC檢測的最佳波長為350nm。在17份材料中，‘野生黃花1號’、‘北黃花’、‘東莊黃花’、‘沖里花 1 號’、‘金娃娃 1 號’、‘大荔黃花’、‘長嘴子花1號’、‘茄子花1號’和‘茶子花’等9份材料花蕾中檢測出秋水仙堿，而其它8份材料均未檢測出秋水仙堿。其中秋水仙堿含量最高的是‘野生黃花 1號’，為 0.218μg/g；其次是‘北黃花’，為0.204μg/g；含量最低的是‘長嘴子花 1號’，為0.156μg/g。進一步對花蕾中的秋水仙堿含量與花色進行了相關性分析，結果表明相關系數(shù)高達-0.894。

萱草屬植物中因含有秋水仙堿而被研究者關注，主要有兩方面的原因：一是研究秋水仙堿的藥理作用，二是為了探究萱草屬植物花蕾食用的安全性[11-13]。關于秋水仙堿的測定方法已有報道，有差示脈沖極普法[14]、伏安法[15]、熒光法[16]以及 HPLC[17-19]法，以 HPLC 居多。本研究通過3D掃描，在200～400nm內(nèi)檢測到兩處秋水仙堿最大吸收峰，其對應波長分別為243nm和350nm。其中在243nm處檢測的秋水仙堿色譜峰的前面有小峰干擾，而350nm處的秋水仙堿色譜峰既沒有其他峰干擾，也無拖尾現(xiàn)象，這與劉桂花等[20]用HPLC法測定復方蘇潤江滴丸中秋水仙堿和卞曉嵐等[17]利用高效液相色譜法測定復方秋水仙堿膠囊中秋水仙堿含量時的波長選擇的選定相一致，同時符合國標法[21]中測定秋水仙堿的波長選擇。

表2 供試樣品中秋水仙堿含量

表3 花色與秋水仙堿含量之間的相關系數(shù)

研究報道，臨床上，秋水仙堿中毒者多因過量攝入含有秋水仙堿的黃花菜，或者長期服用含有秋水仙堿藥片所致[22]，短期血液中秋水仙堿量達0.5mg/kg，致死率上升[23]。在17份萱草屬植物花蕾中，有9種萱草屬植物中檢測出秋水仙堿，含量最低和最高的分別是‘長嘴子花1號’和‘野生黃花1號’，分別為0.156μg/g和0.218μg/g，而在其它8種萱草屬植物花蕾中均未檢測出秋水仙堿，原因可能是因為這幾種萱草屬植物中秋水仙堿含量本身極低或不含秋水仙堿，尚需更精確的方法對其進行測定。

本研究結果顯示，秋水仙堿含量與花色的相關系數(shù)為-0.894，其中‘潘龍花’為黃色花，未檢測出秋水仙堿，故在食用前不能單靠花色來區(qū)分鮮黃花菜是否含有秋水仙堿。

[1]中國科學院中國植物志編輯委員會.中國植物志(第十四卷)[M].北京：科學出版社,1980：52-62.

[2]WU ZHENGYI PETER H.Flora of China[M].Beijing：Science Press,2000：91-95.

[3]陳麗飛,董然.萱草屬植物研究進展[J].北方園藝,2007,177(06)：66-69.

[4]劉偉.鮮黃花菜致秋水仙堿中毒2例 [J].人民軍醫(yī),2006,(11)：676-677.

[5]彭麗珍.鮮黃花菜中毒34例臨床分析[J].臨床薈萃,2005,(12)：675.

[6]汪乃興,趙濱,陳建民.萱草根和藜蘆中秋水仙堿的差示脈沖極譜測定[J].化學世界,1991,(07)：314-316.

[7]劉陳力為,劉雁,匡瓊秀,等.超聲波法提取黃花菜中秋水仙堿的研究[J].湖南城市學院學報(自然科學版),2012,21(01)：69-71.

[8]臺海川,卯明霞,彭霞,等.RP-HPLC法測定秋水仙堿[J].藥物分析雜志,2006,(07)：1014-1016.

[9]劉陳力為,劉雁,匡瓊秀,等.超聲波法提取黃花菜中秋水仙堿的研究[J].湖南城市學院學報(自然科學版),2012,21(01)：69-71.

[10]張寧,李森,王金耀,等.萱草屬植物花蕾中秋水仙堿含量HPLC檢測體系的優(yōu)化[J].河北農(nóng)業(yè)大學學報,2017,40(05)：48-54.

[11]楊中鐸,李援朝.萱草屬植物化學成分及生物活性研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2002,14(01)：93-97.

[12]劉昕,劉樹英,孫葉迎,等.萱草屬植物研究進展[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學,2014,(03)：138-141.

[13]楊利.萱草屬植物營養(yǎng)成分分析及品質(zhì)評價[D].吉林農(nóng)業(yè)大學,2014.

[14]汪乃興,趙濱,陳建民.萱草根和藜蘆中秋水仙堿的差示脈沖極譜測定[J].化學世界,1991,(07)：314-316.

[15]于素華,胡效亞,冷宗周.碳糊電極陽極伏安法測定秋水仙堿[J].藥學學報,1997,32(03)：51-53.

[16]李桂枝,劉永明.熒光法測定片劑中的秋水仙堿[J].分析試驗室,1999,(03)：78-80.

[17]卞曉嵐,翟青,張芳華,等.高效液相色譜法測定復方秋水仙堿膠囊中秋水仙堿的含量[J].廣東微量元素科學,2004,(06)：41-44.

[18]袁理春,徐中志,趙琪,等.麗江山慈姑秋水仙堿HPLC測定[J].西南農(nóng)業(yè)學報,2007,(01)：120-122.

[19]李巖,李曉靜,程雪梅,等.HPLC法測定秋水仙藥材中秋水仙堿[J].中成藥,2013,35(01)：203-205.

[20]劉桂花,何承輝,邢建國,等.HPLC法同時測定復方蘇潤江滴丸中秋水仙堿、蘆薈苷及蘆薈大黃素的含量[J].藥物分析雜志,2013,33(03)：409-413.

[21]中華人民共和國衛(wèi)生部編.中華人民共和國藥典(二部)[S].2000年版,北京：人民衛(wèi)生出版社,2000：492.

[22]李嘉琳,邱澤武,孫愛麗,等.UFLC-MS/MS法測定中毒患者血清中秋水仙堿[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2012,22(11)：2571-2573.

[23]Finkelstein Y,Aks SE,et al.Colchicine poisoning：the dark side of an ancient drug[J].Clin Toxicol(Phila),2010,48(5)：407-414.