姚歡，林育純，林忠寧

(分子疫苗學(xué)和分子診斷學(xué)國家重點實驗室，廈門大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，福建廈門361102)

作為真核細胞極為重要的細胞器，線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)在細胞生命活動中緊密聯(lián)系，已發(fā)現(xiàn)在線粒體外膜與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜之間存在特殊的由特定蛋白質(zhì)經(jīng)由物理連接形成的亞細胞器結(jié)構(gòu)，即線粒體關(guān)聯(lián)性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes，MAM)[1]。研究表明，MAM的功能與鈣(Ca2+)信號調(diào)控、線粒體質(zhì)量控制(mitochondrial quality control，MQC)、ER應(yīng)激和脂質(zhì)代謝等都有著密切聯(lián)系[1]；MAM已經(jīng)被鑒定為細胞命運的調(diào)節(jié)樞紐，其調(diào)控機制與MAM功能蛋白和Ca2+信 號密切相關(guān)[2]。

1 MAM的生物學(xué)特性

2006年Gy?rgy等[3]采用透射電子顯微鏡技術(shù)，確證了線粒體和ER之間MAM區(qū)域保持穩(wěn)定的膜間距，通常是25nm左右，不發(fā)生膜融合。MAM依賴其結(jié)構(gòu)中作為物理連接的特定蛋白質(zhì)組分，不僅為線粒體和ER相互作用提供了復(fù)雜多樣的結(jié)構(gòu)組成的空間基礎(chǔ)，而且為各種信號通路相關(guān)蛋白質(zhì)分子的“募集”或“組合”提供一個功能平臺。由此，MAM結(jié)構(gòu)及功能的協(xié)調(diào)穩(wěn)定是維持細胞正常生理功能的物質(zhì)基礎(chǔ)，經(jīng)由ER和線粒體的質(zhì)量控制及其動態(tài)調(diào)節(jié)、以及二者Ca2+流變化、ER應(yīng)激、線粒體相關(guān)性細胞凋亡等方面的調(diào)控，介導(dǎo)外源性環(huán)境因素誘導(dǎo)的細胞毒性、致癌作用、神經(jīng)退行性變、代謝性疾病等細胞的轉(zhuǎn)歸和命運結(jié)局[1]。見圖1。

1.1 MAM的結(jié)構(gòu)組成

圖1 MAM的結(jié)構(gòu)組成及其功能

已有報告數(shù)十種蛋白質(zhì)可分布或招募在MAM上，形成和維持其結(jié)構(gòu)組成。MAM不同組分之間，可通過形成大的功能復(fù)合體、以及經(jīng)由結(jié)構(gòu)上或功能上復(fù)雜的相互影響，構(gòu)成多樣性功能的分子基礎(chǔ)。已明確的，分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白75(glucoseregulated protein75，GRP75)連接位于ER膜的鈣釋放通道1,4,5-三磷酸肌醇受體(inositol1,4,5-trisphosphatereceptor，IP3R)和線粒體外膜的電壓依賴性陰離子通道1(voltage-dependent anion channel1，VDAC1)上，形成復(fù)合物在MAM的二個膜之間起到物理連接作用[4]。見圖1。

隨著MAM研究的深入，不斷有新的蛋白組分被發(fā)現(xiàn)在MAM上，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化還原酶-1α、蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase2A，PP2A)、炎性小體NLRP3等被證實在MAM上發(fā)揮重要的物理連接作用?？傊?，MAM上這些各異的蛋白分子既是其物理結(jié)構(gòu)組成的分子基礎(chǔ)，又是其具體行使功能的承載者。已研究發(fā)現(xiàn)的MAM重要蛋白分子見表1；并且還有更多的MAM結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)蛋白需要進一步探究。

1.2 MAM的鈣信號調(diào)控功能

MAM中多種蛋白與Ca2+信號調(diào)控相關(guān)，除IP3R、VDAC、GRP75等結(jié)構(gòu)組分外，還包括鈣聯(lián)蛋白、MCU等特異性功能蛋白，見表1，共同形成有效的細胞器間Ca2+轉(zhuǎn) 運機制[1]。ER外膜上IP3R的激活可使ER腔內(nèi)Ca2+釋放出來，在分子伴侶GRP75的幫助下，由線粒體外膜上Ca2+通道VDAC1攝入和經(jīng)由線粒體內(nèi)膜的MCU進入線粒體基質(zhì)中。由此形成MAM中Ca2+信號流，經(jīng)由ER和線粒體進行嚴格的調(diào)控，行使Ca2+信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，見圖1。

1.2.1 MAM功能中的ER相關(guān)Ca2+信號調(diào)控ER是細胞內(nèi)主要的Ca2+儲 存庫，是MAM功能性Ca2+流 的起始。胞漿Ca2+主要通過ER外膜上的SERCA進入ER，維持ER中正常Ca2+水 平[5]。SERCAs家族有 A TP2A1、 A TP2A2和ATP2A3三種不同的基因，各自轉(zhuǎn)錄和翻譯成不同的變異體；其中SERCA2b具有最高的Ca2+親和力，其功能對于ER正常的Ca2+攝取和細胞死亡的調(diào)節(jié)機制至關(guān)重要，是MAM行使Ca2+轉(zhuǎn) 運功能的源泉[5]。

表1 MAM結(jié)構(gòu)組成中的主要蛋白及其生物學(xué)作用[1]

ER的Ca2+可以通過尼丁受體(ryanodinereceptor，RyR)和IP3R兩個通道釋放到胞漿[6]，二者是維持ER中Ca2+穩(wěn)態(tài)不可缺少的另一類蛋白質(zhì)；其中RyR主要在滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中表達(通常用做平滑肌和橫紋肌細胞中的整個ER的標志物)，其與細胞死亡之間的聯(lián)系目前研究較少。IP3R則是在所有細胞類型中普遍表達的電導(dǎo)非選擇性陽離子通道，是MAM的結(jié)構(gòu)組成成分，其在細胞命運調(diào)控中的作用已有大量研究。IP3R通道存在3種不同的亞型(IP3R1、IP3R2和IP3R3)，都可以被第二信使IP3、Ca2+、Ca2+結(jié)合蛋白和ATP激活，并且受硫醇修飾和磷酸化的幾種蛋白(包括癌基因和抑癌基因編碼蛋白)等的調(diào)控[7]。由此構(gòu)成各種細胞MAM中Ca2+流轉(zhuǎn)運的基礎(chǔ)。

1.2.2 MAM功能中的線粒體相關(guān)Ca2+信號調(diào)控線粒體可以攝取從ER釋放的Ca2+、 并儲存少量的Ca2+以維持正常的功能。線粒體是MAM轉(zhuǎn)運Ca2+流 的終點；Ca2+主要通過VDAC1進入線粒體外膜，到達線粒體膜間隙，然后通過位于內(nèi)膜的MCU進入線粒體基質(zhì)中(見圖1)，發(fā)揮生物功能[8]。

VDAC在人體細胞內(nèi)有3個異構(gòu)體(VDAC1/2/3)， 其中VDAC1表達最多，在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，表現(xiàn)為VDAC1在MAM定位和選擇性地與IP3R相互作用，從而增強凋亡Ca2+信 號轉(zhuǎn)移到線粒體[2]；并且MAM中的GRP75結(jié)構(gòu)組分允許這個過程，而小干擾RNA(siRNA)沉默GRP75消除了IP3R和VDAC1之間的功能耦合，減少了激動劑(如組胺等)刺激后經(jīng)由MAM 的線粒體Ca2+吸 收[4]。

為了使MAM的Ca2+流達到線粒體基質(zhì)，位于膜間隙內(nèi)部的Ca2+必須通過MCU復(fù)合體。MCU是一個成孔亞基組成的孔道復(fù)合物[9]。MCU的表達與MAM的Ca2+流最終進入線粒體基質(zhì)發(fā)揮功能息息相關(guān)，其表達嚴格依賴于胞質(zhì)Ca2+水平，并涉及核因子環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白，后者直接結(jié)合于M CU基因啟動子而活化轉(zhuǎn)錄[10]，由此調(diào)控MCU參與MAM的結(jié)構(gòu)組分和Ca2+流的功能。

2 MAM與細胞Ca2+依賴性死亡

MAM相關(guān)Ca2+通 道在細胞Ca2+穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)功能中起著重要作用，它們活性的改變可能是細胞命運調(diào)節(jié)的關(guān)鍵原因。細胞Ca2+過載會引發(fā)活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生的級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致線粒體膜電位下降和損傷。MAM蛋白通過綁定Ca2+以及調(diào)節(jié)Ca2+的 釋放和攝取介導(dǎo)細胞內(nèi)Ca2+的流動影響細胞死亡。MAM介導(dǎo)大量Ca2+轉(zhuǎn)運可以促進細胞死亡，而且反應(yīng)的強度和結(jié)果受存在于細胞器上的各種Bcl-2家族蛋白質(zhì)調(diào)控(見圖1)。抗凋亡成員Bcl-2和Bcl-XL抑制Ca2+轉(zhuǎn) 運[11]；促凋亡成員Bax/Bak、Puma和Bik刺激Ca2+轉(zhuǎn) 運[12]。定位于線粒體和ER的Bax和Bak過表達促進凋亡相關(guān)Ca2+進程；而Bax/Bak雙敲除小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryo fibroblasts，MEFs)，則對Ca2+依賴性死亡刺激具有高度抗性[13]。

2.1 MAM相關(guān)ER鈣泵與細胞Ca2+依賴性死亡

MAM中ER鈣泵和Ca2+通 道控制的Ca2+流信號是生理和病理狀況下決定細胞命運的主要因素；有兩種主要的ER駐留蛋白參與這些過程。第一種是SERCA，其過表達不僅增加ER的Ca2+水平，而且在暴露于促凋亡物質(zhì)(如HBV)時也增加了肝癌Huh7細胞的凋亡敏感性[14]。兩個SERCA1剪接變異體編碼的截短蛋白在Ca2+結(jié)合結(jié)構(gòu)域的特征改變與ER中Ca2+穩(wěn) 態(tài)水平降低和Ca2+釋放增加有關(guān)，最終會導(dǎo)致Huh7細胞和宮頸癌HeLa細胞凋亡；而且SERCA1截短異構(gòu)體的過表達會誘發(fā)HeLa細胞中的ER應(yīng)激，并通過增加MAM偶聯(lián)結(jié)構(gòu)和線粒體Ca2+積 累來放大凋亡反應(yīng)[14]。

MAM中另一種維持ER鈣穩(wěn)態(tài)的蛋白IP3R通過其表達水平和磷酸化的變化，調(diào)節(jié)Ca2+從ER轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)其他地方(特別是線粒體內(nèi))，最終會改變細胞對死亡的敏感性。大量研究發(fā)現(xiàn)，MAM中IP3R在調(diào)控細胞命運和細胞死亡機制中起關(guān)鍵作用(見圖1)。IP3R敲除的雞淋巴瘤DT40細胞自噬增加，而IP3R穩(wěn)定表達可完全恢復(fù)這些IP3R敲除細胞的基本自噬水平[15]。IP3R水平的降低會減少Ca2+轉(zhuǎn)運，降低了線粒體代謝和ATP產(chǎn)生，從而觸發(fā)MEFs細胞自噬。腫瘤抑制因子早幼粒細胞白血病蛋白通過影響IP3R活性來調(diào)節(jié)自噬反應(yīng)[16]。PP2A通過去磷酸化IP3R，促進ER的Ca2+外排和MEFs細胞凋亡的發(fā)生[17]。原癌基因和抑癌基因編碼蛋白通過調(diào)節(jié)IP3R表達和活性來發(fā)揮其作用，其中原癌基因編碼的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RAC-αserine/threonineprotein kinase，Akt)介導(dǎo)以磷酸酶依賴方式抑制ER的Ca2+外排來調(diào)節(jié)人胚腎細胞(HEK-293)凋亡，而腫瘤抑制因子(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)通過去磷酸化IP3R來抑制Akt的作用，使得ER的Ca2+釋放增加，促進HEK-293細胞凋亡[18]。靶向MAM的Ca2+轉(zhuǎn)運可能是重建腫瘤細胞凋亡敏感性的有效方法，籍此開發(fā)的小肽BIRD-2 (Bcl-2-IP3受體抑制劑-2)可通過與Bcl-2結(jié)構(gòu)域BH4結(jié)合，防止Bcl-2與IP3R的相互作用[11]，誘導(dǎo)腫瘤細胞Ca2+介導(dǎo)的凋亡，并在小細胞肺癌細胞系中觸發(fā)細胞死亡[19]。Foskett等[20]采用IP3R抑制劑XeB對MAM中IP3R介導(dǎo)的Ca2+流的抑制，使得乳腺癌細胞大量自噬死亡。

2.2 MAM相關(guān)線粒體鈣泵與細胞Ca2+依賴性死亡

VDAC通道是線粒體攝取從ER釋放的Ca2+通過線粒體外膜進入膜間隙的重要MAM組成部分；3種不同的VDAC亞型在哺乳動物組織中表達和顯示相似的通道性質(zhì)，但對線粒體Ca2+過載的凋亡敏感性具有相反的影響。

有研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠成纖維Rat1a細胞中，Akt增加了己糖激酶2(hexokinase2，HK2)的活性，HK2可以和VDAC1相互作用，抑制VDAC1通道，阻止MAM Ca2+轉(zhuǎn)運，減少了線粒體氧化磷酸化和細胞色素C的釋放，從而抑制凋亡；在抑制Akt后，HK2與VDAC1分離，導(dǎo)致VDAC1打開促進MAM的Ca2+流并增加線粒體膜電位[21]。骨髓細胞白血病因子1可以與VDAC1相互作用，增加線粒體Ca2+攝取，從而促進肺癌細胞遷移[22]。Bcl-2家族的抗凋亡成員Bcl-xL與VDAC1相互作用，通過限制Ca2+信號轉(zhuǎn)移到線粒體來保護MEFs細胞免受凋亡[8]。

與VDAC1不同，缺乏VDAC2的MEFs細胞更易發(fā)生凋亡[23]；VDAC2與Bcl-x(S)相互作用并導(dǎo)致Bak釋放而具有抗細胞凋亡作用[24]。研究發(fā)現(xiàn)，VDAC2特異性與Bak相互作用，VDAC2 過表達選擇性抑制Bak激活、并抑制線粒體凋亡；抑制VDAC2使Bak從線粒體轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)其他區(qū)域(如過氧化物酶體膜)[25]。

MCU作為MAM中Ca2+流的最后通道，其亞基和功能的調(diào)節(jié)，會影響線粒體攝取Ca2+，產(chǎn)生過多ROS，從而增加腫瘤細胞發(fā)生凋亡的可能性；MCU激活通路會被鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶依賴的磷酸化抑制，酪氨酸蛋白激酶可以阻止線粒體Ca2+過載、ROS產(chǎn)生以及隨后的大鼠肝細胞凋亡[26]。組胺刺激HeLa細胞時，MCU表達的細胞線粒體Ca2+攝 取增加，導(dǎo)致凋亡[27]；相反地，miR-25減少MCU表達，或者減少與MCU同型的內(nèi)源性復(fù)合物MCUb的表達，它們則減少線粒體Ca2+攝 取，從而減少Ca2+依賴性的HeLa細胞凋亡[28]。

MAM上還有許多蛋白涉及凋亡的調(diào)節(jié)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)p53通過控制MAM中Ca2+轉(zhuǎn)運來調(diào)節(jié)MEFs細胞凋亡[29]。在生長因子刺激MEFs中，定位在MAM上的雷帕霉素位點復(fù)合物2可磷酸化激活A(yù)kt，后者又磷酸化IP3R調(diào)節(jié)MAM的Ca2+功 能[30]。原癌基因編碼蛋白H-Ras則可通過減少MAM的Ca2+轉(zhuǎn)運，抑制小鼠胚胎成纖維3T3NIH細胞的凋亡過程[31]。

3 MAM結(jié)構(gòu)和Ca2+功能調(diào)節(jié)的生物學(xué)作用

3.1 MAM調(diào)節(jié)異常的相關(guān)性疾病

研究表明，在許多疾病的病理過程中都伴隨著MAM結(jié)構(gòu)和功能的改變，MAM的Ca2+功能紊亂可能是某些疾病發(fā)生的重要指標。

MAM是腫瘤細胞代謝和進程的重要調(diào)節(jié)樞紐。有研究表明，與正常肝細胞相比，人肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)細胞中MAM蛋白線粒體融合蛋白Mfn2表達降低，使得細胞對凋亡敏感性降低。而高表達Mfn2可以使HCC細胞中MAM的Ca2+轉(zhuǎn) 運增強，誘發(fā)凋亡[32]。在HeLa細胞中，敲低MAM蛋白中定位于ER的硫氧還蛋白相關(guān)性跨膜蛋白1，會減少MAM接觸位點，降低MAM的Ca2+轉(zhuǎn)運，抑制線粒體代謝，加快腫瘤的生長[33]。丙型肝炎病毒p7蛋白可以促進人肝癌Huh7.5細胞MAM結(jié)構(gòu)增強，導(dǎo)致MAM 的 Ca2+轉(zhuǎn)運水平升高，引發(fā)線粒體Ca2+過載，促進了線粒體ROS產(chǎn)生，導(dǎo)致線粒體功能障礙從而產(chǎn)生代謝適應(yīng)性反應(yīng)，最終降低線粒體氧化磷酸化水平，增強糖酵解和脂肪生成[34]。

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)與MAM的Ca2+功能失調(diào)有關(guān)。已知 α-突觸核蛋白(α-synuclein， α-Syn)在PD的病理過程中具有重要作用；Cali等[35]通過在HeLa細胞中高表達 α-Syn，發(fā)現(xiàn)從ER到線粒體的Ca2+轉(zhuǎn)運增加，證實 α-Syn通過增加MAM結(jié)構(gòu)蛋白含量來調(diào)節(jié)Ca2+穩(wěn) 態(tài)；線粒體Ca2+平衡的破壞，可能是MAM結(jié)構(gòu)功能失衡和神經(jīng)元功能紊亂的潛在因素。阿爾茨海默病病理過程中，也發(fā)現(xiàn)MAM上毒性淀粉樣蛋白水平增高，導(dǎo)致MAM結(jié)構(gòu)增強和Ca2+轉(zhuǎn) 運水平升高[36]。亨廷頓氏病(Huntington’s disease，HD)的特征是突變的亨廷頓蛋白，其導(dǎo)致二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase，PDI)在MAM上積累并觸發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)損傷；使用小分子物質(zhì)LOC14調(diào)節(jié)MAM中的PDI水平，可顯著改善HD疾病模型小鼠的運動功能、減弱腦萎縮和延長存活[37]。

MAM在代謝性疾病中也發(fā)揮重要作用。在瘦素缺陷型ob/ob肥胖小鼠中研究表明，肥胖促進了肝臟MAM結(jié)構(gòu)形成，促使MAM的Ca2+轉(zhuǎn) 運功能增強，造成線粒體Ca2+過載及功能障礙[38]。肥胖癥和2型糖尿病模型小鼠的骨骼肌中顯示出明顯的MAM完整性破壞，這是線粒體功能障礙和胰島素抵抗之前的早期事件；肥胖癥患者肌管中胰島素抵抗與MAM完整性破壞相關(guān)；表明MAM完整性破壞是小鼠和人類肌肉胰島素抵抗相關(guān)的亞細胞改變[39]。MAM作為肝臟中激素和營養(yǎng)信號傳導(dǎo)的重要樞紐，在高糖飲食情況下，可以破壞胰島素抵抗 o b/ob小鼠肝臟MAM結(jié)構(gòu)，干擾MAM的Ca2+轉(zhuǎn)運功能，最終破壞糖代謝穩(wěn)態(tài)；提示MAM介導(dǎo)的ER-線粒體相互作用通路參與代謝性疾病，并指向MAM作為代謝紊亂的潛在治療靶點[40]。

3.2 MAM調(diào)節(jié)外源化學(xué)物誘導(dǎo)的細胞毒性

MAM在外源化學(xué)物暴露誘發(fā)的細胞或機體毒性損傷中有著極其重要的意義。Kyeong等[41]研究發(fā)現(xiàn)，人支氣管上皮16HBE14o細胞暴露于二氧化鈦納米顆粒時，可誘導(dǎo)細胞ER應(yīng)激，破壞MAM結(jié)構(gòu)和Ca2+平衡，從而增加自噬。腎上腺皮質(zhì)癌的最有效抗癌藥物米托坦作用于人腎上腺皮質(zhì)H295R細胞，破壞了MAM結(jié)構(gòu)，造成MAM磷脂酰絲氨酸脫羧酶功能障礙，Drp1、乙酰輔酶A結(jié)合結(jié)構(gòu)域3蛋白和轉(zhuǎn)運蛋白的表達水平明顯降低，最終誘發(fā)細胞凋亡[42]。在肝癌HepG2細胞中，棕櫚酸可以破壞MAM結(jié)構(gòu)，抑制MAM的Ca2+轉(zhuǎn)運，從而增強細胞中線粒體ROS產(chǎn)量，抑制胰島素信號；高表達Mfn2部分恢復(fù)了MAM 結(jié)構(gòu)并改善了棕櫚酸引起的胰島素信號抑制[43]。這些研究表明MAM組成結(jié)構(gòu)和功能的高度可塑性，是外源化學(xué)物作用的重要靶點，可能作為預(yù)防和治療外源化學(xué)物誘發(fā)的細胞和機體損傷的干預(yù)靶點。

4 結(jié)語與展望

ER和線粒體作為重要的亞細胞結(jié)構(gòu)，與細胞的功能狀態(tài)密切相關(guān)；環(huán)境因素誘發(fā)的細胞毒性是造成機體損傷和疾病的主要原因；已有研究證明外源化學(xué)物可以靶向作用于細胞器，如線粒體和ER造成應(yīng)激反應(yīng)和損傷，特別是二者特化接觸位點MAM的重要作用也越來越受到關(guān)注。MAM通過ER-線粒體結(jié)構(gòu)偶聯(lián)加強了兩者之間的聯(lián)系，在生理和病理狀態(tài)下通過調(diào)節(jié)固定或招募在MAM上的蛋白組分和結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化，調(diào)控MAM的Ca2+轉(zhuǎn)運功能，影響細胞的轉(zhuǎn)歸和命運。

已報道MAM中存在大量結(jié)構(gòu)組成蛋白；外源化學(xué)物暴露的細胞中，定位于MAM的相關(guān)功能蛋白，如新鑒定發(fā)現(xiàn)MAM中環(huán)氧合酶2(cyclooxygenase2，COX-2)的分布，及其動態(tài)變化和功能學(xué)作用的調(diào)節(jié)，將為闡明MAM相關(guān)毒性(如致癌作用)機制和篩選生物標志提供新的突破；同時，探討經(jīng)由靶向干預(yù)MAM關(guān)鍵組分蛋白表達和修飾介導(dǎo)的細胞(器)損傷和毒性效應(yīng)的病理過程調(diào)控，有望為探索細胞器之間接觸位點的靶向干預(yù)，開展外源物(如環(huán)境誘變劑)暴露誘導(dǎo)毒性作用的評價和有害生物效應(yīng)的預(yù)防控制策略提供新的視點。

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