屈云萍，李菲，劉育強，楊斯斯，黃寧，姜國志

(1.神威藥業(yè)集團有限公司，河北 石家莊 051430；2.中藥注射劑新藥技術(shù)開發(fā)國家地方聯(lián)合工程實驗室，河北 石家莊 051430)

六味地黃丸是最著名的經(jīng)典方劑之一，滋陰補腎，用于頭暈耳鳴、腰膝酸軟、遺精盜汗，臨床應用范圍極其廣泛。近年來，不少學者對六味地黃丸進行了廣泛而深入地研究，并取得了較大的進展，文獻[1]統(tǒng)計分析了1995—2000年以來六味地黃丸的研究，共計544篇，但其中的制藥工藝研究僅有7篇，占總文獻量的1.29%，且六味地黃丸含量控制項中，丹皮酚的含量、丸芯溶散時限受干燥溫度及干燥時間的影響較大[2]，同樣的，軟材的粘合性、成型性對壓丸得率也有很大的影響。本文通過星點設計-效應面法多指標評價，對六味地黃丸制備工藝進行優(yōu)化研究，旨在穩(wěn)定產(chǎn)品質(zhì)量。

星點設計[3-6](central composite design，CCD)廣泛應用于處方優(yōu)化和制劑工藝，星點設計與常用的正交設計、均勻設計法相比，具有非線性擬合的特點，其結(jié)果可采用集數(shù)學和統(tǒng)計學方法于一體的效應面法進行優(yōu)化，實驗精度高，預測值更接近真實值，試驗次數(shù)少，CCD-RSM廣泛應用于處方優(yōu)化和制劑工藝，該實驗設計法既能考察各自變量對因變量的影響及各自變量間交互作用，也能進行各自變量的最優(yōu)化，建立數(shù)學模型并做出相應的三維因變量曲面圖，對自變量與因變量的關(guān)系進行直觀的量化分析，CCD-RSM可較好地描述依賴變量和非依賴變量之間的關(guān)系。該方法直觀性、方便性及預測性均比正交和均勻設計優(yōu)化更好。

1 材料與儀器

六味地黃浸膏、藥粉(神威藥業(yè)集團有限公司中藥提取車間提供)；丹皮酚對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110708-201407)；甲醇(色譜純，天津康科德公司)，其余試劑(分析純，市售)。

HC200C槽形混合機(浙江溫州化工機械廠)；中藥自動制丸機(黑龍江制藥機械廠)；荸薺式打光鍋(寶雞制藥機械廠)；熱風循環(huán)烘箱(常州范群干燥設備有限公司)；BJ-Ⅱ型智能崩解儀；紫外可見分光光度計。

2 方法與結(jié)果

2.1 六味地黃丸制備工藝

牡丹皮用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)性成分；藥渣與部分酒萸肉、熟地黃、茯苓、澤瀉加水煎煮二次，每次2 h，煎液濾過，濾液合并，濃縮成稠膏；山藥與剩余酒萸肉粉碎成細粉，過篩，混勻；與上述稠膏和牡丹皮揮發(fā)性成分混勻，制丸，干燥，打光，即得。

2.2 丹皮酚含量的測定

采用高效液相色譜法測定[7]。

2.3 質(zhì)量評價指標

以水分、丹皮酚含量、溶散時限、外觀質(zhì)量分數(shù)為評價指標，采用單因素試驗研究浸膏相對密度、潤濕劑用量、干燥溫度、干燥時間4個影響因素對六味地黃丸制備工藝的影響。

六味地黃丸為濃縮丸，為規(guī)避丸劑的粒徑大小及重量對溶散時限的影響，本試驗嚴格按規(guī)格控制在每8丸重1.44 g(每8丸相當于飲片3 g)，即每丸重0.18 g，且在試驗階段通過篩分、揀選出不符合粒徑、丸重要求的丸子。

2.3.1 水分(Y1) 按水分測定法(通則0832第四法)測定[8]103。

2.3.2 丹皮酚含量(Y2) 按2.2項下方法測定。

2.3.3 溶散時限(Y3) 取六味地黃丸6丸，選擇孔徑約2.0 mm篩網(wǎng)的吊籃，照溶散時限檢查法(通則0921)測定[8]118。

2.3.4 外觀質(zhì)量分數(shù)(Y4) 隨機取不同條件制備的丸芯各50丸，分別對各組丸芯的外觀進行評分，設定圓整度、硬度、色澤等3個外觀評價指標，分別占45、25、30分，滿分為100分，將各指標評分相加作為丸芯的外觀得分。

以Y1，Y2，Y3，Y4的總評“歸一值”(overall desirability，OD)為評價指標[9]，根據(jù)4個指標對丸芯質(zhì)量影響的重要性，設定各自權(quán)重分別為40%、20%、30%、10%。

OD值=(Y1/Y1max)×40%+(Y2/Y2max)×20%+(1-Y3/Y3 min)×30%+(Y4/Y4max)×10%

(1)

式中Y3越小越好。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗結(jié)果

3.1.1 浸膏相對密度的影響 處方中六味地黃浸膏的量占比較大，與藥材原粉及其余物料混合攪拌制備軟材后壓丸，本試驗分別考察4個不同相對密度的浸膏按照2.1的方法壓制丸芯，考察軟材的性狀、壓制成條性、丸重差異及丸芯成型，結(jié)果見表1。

結(jié)果表明：相對密度1.38、1.40時，軟材黏性適中，壓丸容易成條，丸重差異小且丸面光滑，成型較圓整，因此可以選用1.39為中線做進一步考察。

3.1.2 潤濕劑的選擇 制備軟材時用到的潤濕劑為純化水和乙醇，兩者以不同的比例進行配合，另外乙醇用量比例較大時，能很好的改善丸芯的溶散，但同時軟材黏性就會降低，導致壓丸不易，本試驗考察以純化水、乙醇為潤濕劑，按2.1的方法制備丸芯，考察軟材的性狀、壓制成條性、丸重差異及溶散時限，結(jié)果見表2。

表1 浸膏相對密度的影響

表2 潤濕劑的選擇

結(jié)果表明：純化水∶乙醇為1∶2時，軟材硬度適宜、黏性適中，壓制易成條、條面光滑，丸重差異小，且溶散時限合格，因此選擇純化水∶乙醇為1∶2為潤濕劑，后續(xù)做用量的進一步考察。

3.1.3 干燥溫度的影響 用浸膏相對密度為1.39(30 ℃)、選擇潤濕劑為純化水∶乙醇1∶2，按照2.1的方法制備丸芯，放入熱風循環(huán)烘箱內(nèi)干燥，根據(jù)經(jīng)驗分別選擇55、60、65、70 ℃的干燥溫度，干燥相同的時間，考察丹皮酚含量、水分、溶散時限，結(jié)果見表3。

表3 干燥溫度的影響

結(jié)果表明：不同的干燥溫度，干燥相同的時間，丹皮酚及溶散時限差異不明顯，但70 ℃干燥的丸芯含水量較低，對丸芯的質(zhì)量保證更加可靠，因此后續(xù)選擇70 ℃為中線做進一步考察。

3.1.4 干燥時間的影響 按照2.1的方法制備丸芯，用浸膏相對密度為1.39(30 ℃)、選擇潤濕劑為純化水∶乙醇為1∶2，干燥溫度為70 ℃，選擇不同的干燥時間，考察丹皮酚含量、水分、溶散時限、丸芯外觀，結(jié)果見表4。

表4 干燥時間的影響

結(jié)果表明：隨著干燥時間的延長，丹皮酚含量稍有下降，且溶散時限及丸芯外觀受很大的影響，因此選擇18 h為中線做后續(xù)的進一步考察。

3.2 星點設計試驗優(yōu)選六味地黃丸制備工藝

在單因素試驗的基礎上，應用星點設計-響應曲面法多指標對六味地黃丸制備工藝進行優(yōu)化。以浸膏相對密度1.39(30 ℃)(A)、潤濕劑用量6L(40萬丸用量)(B)、干燥溫度70℃(C)、干燥時間18 h(D)為考察因素的中線，以水分(Y1)、丹皮酚含量分數(shù)(Y2)、溶散時限分數(shù)(Y3)、外觀質(zhì)量分數(shù)(Y4)為評價指標，計算OD值。

每個因素選擇3個水平，響應曲面試驗因素水平編碼見表5。

表5 響應曲面試驗因素水平編碼

3.3 響應曲面試驗結(jié)果分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件進行試驗設計，本試驗共含有29個試驗點，其中29個為析因點，5個為零點。析因點為自變量取值在所構(gòu)成的三維頂點，零點為區(qū)域的中心點，其中零點試驗重復5次，用以估算試驗誤差。Box-Behnken試驗方案及結(jié)果見表6。

采用Design-Expert 8.0.6軟件對綜合評分結(jié)果進行二次多元回歸擬合，回歸方程Y=0.39-0.032A-0.027B-0.088C-0.16D-0.025AB-0.045AC-0.095AD-0.055BC-0.015BD-5×10-3CD-0.083A2-0.021B2-0.071C2-0.033D2，相關(guān)系數(shù)r=0.993 8，接近1，說明所建模型與試驗擬合較好。詳細見表7。

表6 Box-Behnken試驗設計及結(jié)果

表7 回歸模型和方差分析

注：*.差異顯著(P<0.05)；**.差異極顯著(P<0.01)。

3.4 各因素間相互作用對結(jié)果的影響

響應曲面圖是根據(jù)回歸方程繪制的，是響應值在各試驗因素交互作用下得到的結(jié)果構(gòu)成的一個三維空間曲面，可以預測和檢驗變量的響應值以及確定變量的相互關(guān)系。AB、AC、AD和BC之間均存在交互作用，根據(jù)回歸方程做出模型的響應曲面及等高線，見圖1。

由圖1可知，軟件最終篩選出的最佳工藝參數(shù)為：浸膏相對密度1.40(30 ℃)、潤濕劑(純化水∶乙醇為1∶2)用量(40萬丸用量)6.58 L、干燥溫度65 ℃、干燥時間16 h，此狀態(tài)OD值為0.570 8。

3.5 最佳工藝參數(shù)的驗證

按照響應面法優(yōu)化的工藝條件進行3批驗證，三批丹皮酚含量分別為0.47、0.45、0.42 mg/丸；水分分別為6.8%、6.5%、6.2%；溶散時限分別為39、36、34 min；將數(shù)據(jù)用2.3.4的方法計算OD值，分別為0.571 9、0.571 1、0.571 5，與預測OD值比較，偏差為-0.19%、-0.05%、-0.12%。因此，實踐結(jié)果與模型預測值基本一致，所以利用響應面法得到的六味地黃丸制備工藝參數(shù)穩(wěn)定可靠，具有一定的應用價值。

3.6 丸芯整形、打光及結(jié)果

將丸芯置打光鍋中，啟動打光鍋，用95%乙醇及純化水適量潤濕丸粒，然后交替將藥汁和50%左右乙醇噴灑至丸芯表面，直至丸芯表面平整，加入滑石粉和藥用炭的混合粉末整形至丸面光滑、細膩，撒蟲白蠟繼續(xù)打光40～60 min，然后加入2%硅油蠟打光至光亮，并考察丸子外觀、丸重差異、檢測丹皮酚含量、溶散時限、水分，結(jié)果見表8。

圖1 等高線和響應面圖

表8 3批驗證丸芯整形、打光后結(jié)果

4 結(jié)論

效應面法是采用多元二次回歸方程來擬合效應值與因素之間關(guān)系的一種優(yōu)化統(tǒng)計方法，該設計法具有精度高、預測性好的特點，現(xiàn)已廣泛用于藥學研究領(lǐng)域[10]。本試驗通過單因素考察和響應曲面分析對六味地黃丸制備工藝進行優(yōu)化，最終篩選出的最佳工藝參數(shù)為：浸膏相對密度1.40(30 ℃)、潤濕劑用量(40萬丸用量)6.58 L、干燥溫度65 ℃、干燥時間16 h，此狀態(tài)OD值為0.570 8。

5 討論

目前針對濃縮丸的干燥方式有很多中，據(jù)文獻[11-12]報道的有微波干燥、烘箱干燥，本試驗是按照熱風循環(huán)烘箱開展的研究，優(yōu)化的制備工藝，待后續(xù)繼續(xù)開展等其他的干燥方式，尤其是微波干燥時對丸子內(nèi)部成分的影響，以提高產(chǎn)能和效率。另外濃縮丸的生產(chǎn)工藝不同，可能會導致體外溶出度的差異性，如濃縮丸藥材的粉碎程度[13]，藥粉混合的均勻性，成藥的硬度等都對其有一定的影響，故制作工藝的標準化是提高藥品質(zhì)量的重要方面[14]，在本試驗的基礎上要持續(xù)優(yōu)化其他影響質(zhì)量穩(wěn)定性的因素。

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