姚婷婷 蒲小龍 葉露瑩 宋敏娜 李小婷 葉如夢(mèng) 寧俊楠 郭志雄 佘文琴 潘東明

摘 要 以3年生中國(guó)水仙品種‘金盞銀臺(tái)主芽為試驗(yàn)材料，經(jīng)5和35℃變溫貯藏水仙球，通過(guò)石蠟切片形態(tài)解剖學(xué)觀察主芽活力，利用qRT-PCR方法分析水仙主芽在貯藏時(shí)期ABA和GA相關(guān)基因表達(dá)變化。結(jié)果表明，水仙主芽生長(zhǎng)點(diǎn)的細(xì)胞排列緊密，35℃高溫貯藏有利于水仙主芽的生長(zhǎng)發(fā)育。qRT-PCR分析表明，貯藏期間ABA合成和代謝相關(guān)基因呈現(xiàn)不規(guī)則變化趨勢(shì)，變溫貯藏對(duì)NtABA2基因影響顯著；GA相關(guān)基因整體呈下降趨勢(shì)，變溫貯藏對(duì)NtGA20X基因影響顯著。

關(guān)鍵詞 變溫 ；貯藏 ；水仙 ；芽

中圖分類號(hào) S682.2+1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2018.02.010

Abstract Bulbs of Narcissus variety Jinzhanyintai at the age of 3 years old were stored at the changing temperatures of 5 C and 35 C and was embedded in paraffin and cut into sections for morphological and anatomical observation of the vigor of their main buds. The change of the ABA and GA - related gene expression of the main buds of the bulbs during the storage was analyzed by using the qRT-PCR. The results showed that the cells of the main buds of Narcissus bulbs in the growth points were closely arranged， and their storage at the high temperature of 35 C was beneficial to the growth of Narcissus main buds. The qRT-PCR analysis showed that the genes related to ABA synthesis and metabolism tended to change irregularly， and that the storage at the changing temperature had significant effect on NtABA2 gene. The GA-related genes tended to decrease in general， and the storage at the changing temperature had significant effect on NtGA20X gene.

Keywords changing temperature ； storage ； Narcissus ； bud

中國(guó)水仙（Narcissus tazetta var. chinensis）屬石蒜科水仙屬多年生草本植物，具有很高的觀賞價(jià)值，是中國(guó)十大名花之一，在春節(jié)開(kāi)花，受到很多人的喜愛(ài)。中國(guó)水仙因夏季高溫?zé)o法繼續(xù)生長(zhǎng)而以鱗莖芽的形式進(jìn)入休眠，溫度是影響水仙休眠的重要因素之一[1]，溫度也是影響植物休眠解除重要的環(huán)境因素[2-3]。

溫度不同對(duì)植物休眠解除結(jié)果也不同，高溫（高于70℃）能夠打破豆科種子物理休眠[4-5]，高溫也可打破有些植物休眠。孫紅梅等[6]發(fā)現(xiàn)，利用變溫處理方式可解除百合鱗莖休眠；高東升等[7]和熊國(guó)勝等[8]發(fā)現(xiàn)，5℃是打破休眠的最佳溫度，但是也有些植物是在0℃以下打破休眠，而某些植物在低于0℃的環(huán)境下反而促進(jìn)休眠，夜晚-13～-4℃的溫度可促進(jìn)美國(guó)山核桃的芽萌發(fā)[9]。

脫落酸（ABA）和赤霉素（GA）是影響植物生長(zhǎng)的重要激素，其中ABA 是調(diào)控種子休眠和萌發(fā)重要的植物激素；赤霉素是廣泛存在的一類植物激素，其功能是促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和打破休眠等。ABA合成和降解受到很多基因的調(diào)控，其中NtCYP和NtNCED是其合成的重要基因[10]，NtNCED 是其合成的關(guān)鍵酶，也是 ABA 整個(gè)生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控酶[11]。赤霉素（GA）能夠解除植物休眠，促進(jìn)種子萌發(fā)，對(duì)植物生長(zhǎng)起著重要的作用。

目前關(guān)于水仙休眠的研究很少與ABA和GA相關(guān)基因聯(lián)系起來(lái)，尚未見(jiàn)類似的報(bào)道。本研究以水仙主芽為材料，測(cè)定變溫貯藏對(duì)中國(guó)水仙主芽形態(tài)學(xué)和基因表達(dá)含量變化的影響，對(duì)進(jìn)一步研究變溫貯藏的水仙休眠機(jī)制具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為中國(guó)水仙‘金盞銀臺(tái)3年生的水仙球，來(lái)自福建省漳州市商業(yè)種植基地。試驗(yàn)處理：貯藏1組，將3年生中國(guó)水仙球置于5℃貯藏45 d后放到35℃中；貯藏2組，于5℃貯藏75 d放后放到到35℃中。2016年8月3日開(kāi)始采樣，第2次取樣周期間隔30 d，之后每隔15 d取樣一次，共取樣5次。選取水仙球的主芽作為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 石蠟切片的制作材料處理和固定

用解剖刀取出主芽，立刻放到固定液FAA（5 mL甲醛+5 mL冰醋酸+90 mL70%乙醇）中，固定好后備用。

脫水。將固定后的材料，依次經(jīng)過(guò)70%、85%、95%、100%乙醇脫水，每次2 h。

透明。用無(wú)水乙醇∶二甲苯（V∶V=1∶1）過(guò)渡2 h，二甲苯透明2次，每次1 h。

浸蠟。逐步往二甲苯中加入石蠟碎屑，二者體積比約為1∶1，放入37℃恒溫箱內(nèi)過(guò)夜，次日用含有石蠟和二甲苯（V∶V=3∶1）的溶液于58℃浸泡2 h，之后用純石蠟于65℃浸泡1 h，連續(xù)換5次純石蠟溶液，每次1 h。

包埋。提前打開(kāi)包埋機(jī)和冷凍機(jī)，備好紙盒，將主芽放入紙盒內(nèi)，用鑷子固定好位置。

修蠟塊和切片。根據(jù)所切的位置修整蠟塊，將修好的蠟塊粘在包埋盒上并做好標(biāo)記；提前打開(kāi)烘片機(jī)和展片機(jī)，將包埋盒置于自動(dòng)切片機(jī)上，切片厚度約為10～12 μm，切片的過(guò)程中不斷觀察，直至切到所需的位置；將蠟條展開(kāi)，用粘附性載玻片將蠟條平整地?fù)破?，在烘片機(jī)上烘干。

細(xì)胞核染色。參照丁安琪[1]的方法，略作修改。將石蠟切片放入純二甲苯中20 min，重復(fù)1次，轉(zhuǎn)入無(wú)水乙醇∶二甲苯（V∶V=1∶1）溶液中5 min；分別用100%、95%、85%、70%、50%、30%乙醇浸泡5 min，接著分別置于蒸餾水中5 min，后置于蘇木精染色液中30 min；染色后用自來(lái)水沖洗12 min，之后分別用30%、50%、70%、85%、95%、100%乙醇脫水，各3 min；脫水后置于無(wú)水乙醇∶二甲苯（V∶V=1∶1）溶液中3 min ，用純二甲苯透明5 min，最后用中性樹(shù)脂封片。

觀察。用LEICA（DMi8）顯微鏡對(duì)主芽活力變化進(jìn)行觀察和拍照。

1.2.2 總RNA提取與cDNA合成

中國(guó)水仙總RNA提取參照Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（DNA-free）說(shuō)明書提取。cDNA合成采用TAKARA公司的PrimeScript RT reagent Kit，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書。

1.2.3 熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)

內(nèi)參基因和目的基因熒光定量引物均采用本實(shí)驗(yàn)室蒲小龍[12]實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的引物（表1），選用actin基因?yàn)閮?nèi)參基因。

1.2.4 定量PCR反應(yīng)體系及程序

參照TAKARA公司SYBR Premix Ex-TaqTM（Tli RNaseH Plus）說(shuō)明書，在定量PCR儀中進(jìn)行，PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 水仙主芽活力分析

采用蘇木精對(duì)中國(guó)水仙主芽進(jìn)行染色，觀察主芽生長(zhǎng)點(diǎn)形態(tài)的改變和細(xì)胞核活力狀況。結(jié)果顯示，水仙主芽生長(zhǎng)點(diǎn)往上呈三角形生長(zhǎng)同時(shí)分化鱗片。貯藏2組主芽生長(zhǎng)的速度較貯藏1組快，其生長(zhǎng)點(diǎn)分化出的鱗莖變長(zhǎng)且排列較稀疏。貯藏75 d后，貯藏1組水仙主芽生長(zhǎng)點(diǎn)呈山峰狀快速生長(zhǎng)分化（圖1-B1）；貯藏120 d后水仙主芽生長(zhǎng)錐的染色程度深，細(xì)胞小而且與鱗片之間排列緊密（圖1-E1）。貯藏1組主芽生長(zhǎng)點(diǎn)染色程度比貯藏2組深，貯藏2組細(xì)胞排列稀疏而且生長(zhǎng)點(diǎn)細(xì)胞大。于5℃貯藏45 d和75 d后水仙主芽生長(zhǎng)點(diǎn)發(fā)育緩慢（圖1-A1、1-B2），于35℃貯藏時(shí)水仙主芽生長(zhǎng)點(diǎn)形態(tài)發(fā)育較快（圖1- B2、1-C1、1-D1、1-E1）。

2.2 中國(guó)水仙主芽ABA和GA相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量變化

對(duì)中國(guó)水仙球變溫貯藏期間ABA和GA相關(guān)基因進(jìn)行熒光定量分析，結(jié)果如圖2所示，除了NtZEP和NtNCED外，其余基因均差異顯著。

中國(guó)水仙主芽貯藏1組：ABA合成相關(guān)基因NtZEP和NtABA2表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，但NtABA2表達(dá)量貯藏75 d后明顯下降且保持在較低的水平；NtNCED和NtAAO3表達(dá)量呈 “上升-下降”的變化趨勢(shì)，貯藏75 d時(shí)基因表達(dá)量高于其它時(shí)期，貯藏75 d后呈下降趨勢(shì)；ABA降解相關(guān)基因NtCYP表達(dá)量呈“下降-上升”的變化趨勢(shì)。中國(guó)水仙主芽貯藏2組：ABA合成相關(guān)基因NtNCED和NtZEP表達(dá)量呈“下降-上升”的變化趨勢(shì)，NtAAO3表達(dá)量呈“上升-下降”趨勢(shì)，NtABA2表達(dá)量貯藏90 d后明顯下降，隨后保持在較低的水平；ABA降解相關(guān)基因NtCYP表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。貯藏1組NtCYP基因表達(dá)量在貯藏45 d時(shí)出現(xiàn)最大值，貯藏2組則在75 d時(shí)出現(xiàn)最大值，二者都是在5℃貯藏時(shí)出現(xiàn)最大值。

貯藏1組GA相關(guān)基因NtGA3OX表達(dá)量呈“上升-下降”的變化趨勢(shì)，貯藏2組NtGA3OX呈上升趨勢(shì)；貯藏1組NtGA2OX表達(dá)量呈“上升-下降-上升”的變化趨勢(shì)，貯藏2組NtGA2OX表達(dá)量整體呈下降趨勢(shì)；貯藏1組和2組NtGA20X表達(dá)量整體呈下降趨勢(shì)，貯藏1組在貯藏45 d時(shí)出現(xiàn)最大值，貯藏2組在貯藏75 d時(shí)出現(xiàn)最大值，二者都是在5℃貯藏時(shí)表達(dá)水平高，35℃貯藏時(shí)表達(dá)水平低。

3 討論

通過(guò)對(duì)中國(guó)水仙主芽進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察可知，高溫貯藏有利于水仙主芽形態(tài)發(fā)育，低溫抑制水仙主芽形態(tài)發(fā)育。5和35℃貯藏時(shí)水仙主芽生長(zhǎng)點(diǎn)均分化鱗片，5℃貯藏45 d（1-A1）、75d（1-B2）主芽生長(zhǎng)點(diǎn)均有活力，貯藏75 d時(shí)（1-B2）的活力高些，可能是由于隨著5℃貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，因貯藏溫度過(guò)低導(dǎo)致生長(zhǎng)代謝緩慢，能夠在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持主芽活力，故生長(zhǎng)緩慢。于35℃中貯藏時(shí)，貯藏2組發(fā)育速度高于貯藏1組，表明高溫能夠促進(jìn)水仙主芽形態(tài)發(fā)育。林小蘋等[13]研究發(fā)現(xiàn)，儲(chǔ)藏在高溫條件下的水仙花球成花率明顯高于低溫條件下，可見(jiàn)高溫對(duì)花芽分化有利，低溫顯著降低成花率。鐘衡[14]研究表明，中國(guó)水仙主芽花芽在7月份上旬開(kāi)始分化，8月份花芽分化形成花被，9月形成雌蕊和副花冠。郭蕊等[15]研究表明，東方百合雜種系的西伯利于3～5℃貯藏45 d后休眠解除，花芽開(kāi)始分化；亞洲百合雜種系歌德琳娜于3～5℃貯藏30 d左右休眠被打破，種植1周后花芽分化。上述研究與本研究結(jié)論（5℃貯藏打破休眠）一致，但是5℃貯藏的中國(guó)水仙尚未完成花芽分化。

對(duì)ABA和GA相關(guān)基因表達(dá)水平進(jìn)行分析可知，ABA合成途徑中的相關(guān)基因表達(dá)水平并不一致，NtABA2于35℃中貯藏后，基因表達(dá)量很低，表明高溫貯藏抑制了NtABA2基因表達(dá)，這與水仙遇高溫進(jìn)入休眠的結(jié)論基本一致，NtABA2基因在ABA合成過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用。貯藏1組和貯藏2組NtZEP基因表達(dá)并無(wú)明顯差異，在35℃貯藏時(shí)表達(dá)量均上升，2組表達(dá)水平基本一致，表明該基因維持35℃貯藏時(shí)水仙芽?jī)?nèi)部的ABA水平。貯藏1組NtNCED和NtAAO3呈先上升后下降的變化趨勢(shì)，上升是因?yàn)樵摶驅(qū)?5℃貯藏的脅迫反應(yīng)，下降是由于隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，35℃誘導(dǎo)NtNCED和NtAAO3表達(dá)量低。NtCYP基因表達(dá)呈下降趨勢(shì)，于35℃貯藏后該基因表達(dá)量降低，是由于高溫降低了ABA的降解水平。

對(duì)GA代謝相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析可知，NtGA3OX和NtGA2OX基因相對(duì)表達(dá)量較高。赤霉素合成相關(guān)基因NtGA3OX在35℃貯藏后，貯藏1組表達(dá)量先上升后下降，是由于水仙休眠被打破，赤霉素在這個(gè)階段起著重要作用；貯藏2組表達(dá)量水平呈上升趨勢(shì)，是因?yàn)樵摶虻谋磉_(dá)受限于貯藏時(shí)間。貯藏1組NtGA2OX基因表達(dá)量先上升后下降隨后又上升，貯藏2組整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，表明該基因表達(dá)量受35℃貯藏溫度的影響。在35℃貯藏后NtGA2OX基因表達(dá)水平整體比較低，表明該基因表達(dá)受到35℃貯藏的抑制。

綜上所述，變溫貯藏只能夠打破水仙休眠而無(wú)法完成花芽分化，正常水仙在種植50 d后開(kāi)花，但是變溫貯藏只能長(zhǎng)出葉片，無(wú)法開(kāi)花。從形態(tài)學(xué)觀察得知，水仙主芽形態(tài)依舊是葉芽分化的狀態(tài)。變溫貯藏對(duì)ABA和GA相關(guān)基因表達(dá)水平有很大的影響，其中NtABA2、NtCYP和NtGA20X受35℃貯藏的影響比較大。

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