馮湘沅，成莉鳳，劉正初，鄭科，楊琦，劉志遠(yuǎn)，曾潔，段盛文，彭源德

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，長沙410205）

以微生物為對(duì)象的研究和生產(chǎn)中菌種是必不可少的材料［1］。然而菌種具有易變異的特性，當(dāng)長期使用以及多次轉(zhuǎn)代時(shí)，都會(huì)導(dǎo)致其活力降低［2］。為了降低菌種死亡率、退化率，保持其原有的優(yōu)良性狀，必須對(duì)菌種進(jìn)行保存［3－5］。菌種傳統(tǒng)保存方法主要有轉(zhuǎn)接斜面低溫保藏法、液體石蠟保藏法、甘油培養(yǎng)物保藏法、半固體穿刺保藏法、沙土管保藏法、液氮超低溫保藏法和真空冷凍干燥保藏法等［6－7］。其中，有些方法雖能長期保存，但所需設(shè)備較多，操作復(fù)雜；還有些方法盡管比較簡單，但保存時(shí)間較短，頻繁轉(zhuǎn)代，容易變異。根據(jù)菌株特性，本研究探究了一種操作簡單、保存時(shí)間長、性狀穩(wěn)定的菌種保存方法。

高效脫膠菌株CXJZU－120是由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所選育。1993年分離得到一個(gè)野生菌株T85－260，1996年通過基因工程手段將同種“LY”菌株質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至該菌株得到變異菌株CXJZ95－198，2005年再經(jīng)過紫外線誘變而獲得該變異菌株。2006年以來其在高效節(jié)能清潔型苧麻生物脫膠示范工程中推廣應(yīng)用。本文擬采用抽真空法和甘油冷凍法兩種方法保存高效脫膠菌株CXJZU－120［8］，保存一段時(shí)間后進(jìn)行活化、培養(yǎng)以及脫膠性能比較，以建立一套保存時(shí)間長、性狀穩(wěn)定、操作簡單、不需較多設(shè)備的高效脫膠菌株保存方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

抽真空法保存10年菌株：2007年10月抽真空法保存的高效脫膠菌株CXJZU－120（經(jīng)鑒定命名為Erwinia carotovora）。

抽真空法保存3年菌株：2014年10月抽真空法保存的高效脫膠菌株CXJZU－120。

甘油冷凍法保存3年菌株：2014年10月甘油冷凍法保存的高效脫膠菌株CXJZU－120。CK：不添加菌液的對(duì)照組。

原料：2015年種植、收獲的苧麻韌皮原麻。

活化培養(yǎng)基：牛肉浸膏0.5%、葡萄糖1%、蛋白胨0.5%、氯化鈉0.5%。

擴(kuò)大培養(yǎng)基：豆餅粉1%、K2HPO40.1%、（NH）4H2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.05%。

固體培養(yǎng)基：營養(yǎng)瓊脂4.5%、葡萄糖0.5%。

試劑：羅威邦（Lovibond）COD專用試劑

1.2 主要儀器

OLYMPUS顯微成像分析系統(tǒng)儀：BX53型，日本奧林巴斯公司；生化培養(yǎng)箱：SPX－250B－Z型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；全溫振蕩器：RH－Q型，寧波賽茵儀器有限公司；COD測定儀：ET99718型，德國羅威邦公司；真空泵：2XZ－1型，浙江黃巖求精真空泵廠。

1.3 菌種保存方法

1.3.1 抽真空法

首先挑取純化典型單菌落菌苔，劃線于試管斜面固體培養(yǎng)基，然后將試管放置于恒溫培養(yǎng)箱35℃培養(yǎng)20 h，套入大試管，塞上橡膠空心玻璃管，在大試管與橡膠交界處涂抹石蠟并真空泵抽真空，最后用酒精噴燈燒結(jié)空心玻璃管封存。

1.3.2 甘油冷凍法

首先挑取純化典型單菌落，接種于6 mL活化培養(yǎng)基中，混勻，將其置于恒溫培養(yǎng)箱中35℃培養(yǎng)6 h，然后倒入盛有100 mL擴(kuò)大培養(yǎng)基搖瓶中，搖瓶置于35℃，180 r／min搖床培養(yǎng)6 h后，取等體積的菌液和甘油（濃度30%）混合，最后置于－70℃冰柜冷凍保存。

1.4 活化態(tài)菌液制備

取抽真空法保存3年、10年菌株菌苔各1環(huán)及甘油冷凍法保存3年的200μL解凍菌液分別加入到5 mL活化培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)10 h后，取上述1 mL菌液稀釋涂布于固體培養(yǎng)基平皿，35℃培養(yǎng)20 h，取活化態(tài)典型單菌落接入6 mL活化培養(yǎng)基中，混勻，35℃培養(yǎng)6 h后，倒入至100 mL擴(kuò)大培養(yǎng)基中，35℃、180 r／min培養(yǎng)6 h，按2%的接種量轉(zhuǎn)接至200 mL擴(kuò)大培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng) 6 h［9］。

1.5 接種與脫膠

取6 mL活化態(tài)菌液放入盛有300 mL自來水（預(yù)熱至35℃）的錐形瓶中，混勻，投入30 g苧麻（卷成圈狀），置于35℃、180 r／min全溫振蕩器發(fā)酵。

1.6 取樣及樣品處理

苧麻韌皮通過接種后分別在0.5、2.5、4.5、6.5、8.5、10.5 h取發(fā)酵液樣品（5 mL／瓶，立即用等量無菌水補(bǔ)充，3個(gè)重復(fù)）進(jìn)行活菌量、COD檢測，并觀察苧麻分散程度，同時(shí)設(shè)置對(duì)照組CK（不添加菌液）。

取10.5 h發(fā)酵后的苧麻瓶，置于滅菌高壓鍋中于100℃下滅活30 min，待發(fā)酵苧麻自然冷卻至室溫，用清水?dāng)[洗，將洗滌的苧麻纖維置于室溫下自然風(fēng)干，測失重率。

1.7 性能鑒定［10］

1.7.1 鏡檢

采用草酸銨－結(jié)晶紫染色，顯微成像分析系統(tǒng)儀下觀察活化液菌體形態(tài)、顏色深淺。

1.7.2 活菌量

采用常規(guī)稀釋平板涂布法分離，觀察平板菌落生長數(shù)量，每個(gè)級(jí)別設(shè)置3個(gè)重復(fù)平皿。1.7.3 COD

德國Lovibond，ET99718型COD測定儀，按使用說明書操作。

1.7.4 失重率

苧麻初始重量G0，菌液處理后的苧麻重量G1（計(jì)算3組平均值）。失重率計(jì)算公式為：G（%）＝［（G0－G1）／G0］×100%

2 結(jié)果與討論

2.1 活化菌液鏡檢比較

如圖1（隨機(jī)視野顯微照片）所示，抽真空法保存3年或10年菌株活化菌液均為顏色較深的菌體，表明其均可活化出正常菌體，同時(shí)也可看到少量形態(tài)不規(guī)則菌體。而甘油冷凍法保存3年菌株的活化菌液中除有少量形態(tài)不規(guī)則菌體外，明顯可見顏色深淺不一的菌體，從5個(gè)視野數(shù)出淺色菌體的數(shù)量占平皿菌體總量的23.62%，淺色菌體可認(rèn)為是死亡菌體軀殼或活性能力不強(qiáng)的菌體。因此，抽真空法比甘油冷凍法更適合用于保存高效脫膠菌株CXJZU－120。

圖1 活化菌液顯微照片F(xiàn)ig.1 Themicrograph for activated bacteria solution

2.2 發(fā)酵液活菌量比較

將CXJZU－120活化態(tài)菌液接種到苧麻上進(jìn)行浸泡振蕩發(fā)酵，在該過程中測定其活菌量（LgN）。由圖2所示，抽真空法保存3年、10年的兩支菌株的活菌量（LgN）變化趨勢(shì)基本相同，均隨發(fā)酵時(shí)間的延長顯著增加，數(shù)值比較接近，10.5 h活菌數(shù)（N）均可達(dá)最大值1.02×109cfu／mL，說明采用抽真空法保存10年其活性比較穩(wěn)定，活化后的菌株都能較快適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境。而甘油冷凍法保存3年的菌株由初始活菌數(shù)5.25×104cfu／mL（0.5 h發(fā)酵時(shí)間）增加至活菌數(shù)1.66×107cfu／mL（10.5 h），增長緩慢且數(shù)值偏低。其主要原因可能是有些菌體實(shí)際存在，但活性不強(qiáng)，或是有些菌體從休眠狀態(tài)恢復(fù)到正常生長繁殖狀態(tài)需要較長時(shí)間，對(duì)培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)較慢。為了避免苧麻原料帶來的雜菌對(duì)試驗(yàn)造成的影響，采用不添加菌液組作為對(duì)照組（CK），10.5 h其雜菌活菌數(shù)為1.07×105cfu／mL，遠(yuǎn)低于兩種保存方法的活菌數(shù)，這也進(jìn)一步證明抽真空法可對(duì)CXJZU－120菌株進(jìn)行中、長期保存。

圖2 發(fā)酵液活菌量比較Fig.2 Comparison of the bacteria number in the fermentation broth

2.3 發(fā)酵液COD比較

COD是表示水中有機(jī)物組分含量的一個(gè)指標(biāo)，COD值越大，表明發(fā)酵液中殘存苧麻降解物越多。由圖3可知，抽真空法保存3年、10年的兩支菌株發(fā)酵0.5 h的起始COD值分別為1.97、1.92 g／L，當(dāng)時(shí)間延長至10.5 h，終止COD值分別達(dá)到6.02、5.65 g／L，表明隨著脫膠過程的進(jìn)行，菌株不斷地降解苧麻韌皮非纖維素物質(zhì)而使生成的有機(jī)物越來越多。另外，6.5 h時(shí)，觀察到苧麻纖維完全分散，能完成脫膠。甘油冷凍法保存3年的菌株經(jīng)活化接種后，脫膠過程中COD值隨時(shí)間的延長而緩慢上升，10.5 h的發(fā)酵液COD值為3.96 g／L，此時(shí)苧麻纖維尚未全部分散，說明高效脫膠菌株的脫膠性能對(duì)超低溫冷凍較為敏感。為了避免水溶物質(zhì)或雜菌對(duì)試驗(yàn)的影響，以不添加菌液組作為對(duì)照組，其COD值由1.78 g／L（0.5 h）緩慢上升至2.45 g／L（6.5 h）后呈平穩(wěn)狀態(tài)，其COD值遠(yuǎn)低于兩種保存方法活化菌的值，說明兩種方法保存的菌株對(duì)苧麻均具有脫膠效果，但抽真空法保存的菌株對(duì)苧麻的脫膠效果更好。

圖3 發(fā)酵液COD比較Fig.3 COD comparison of the fermentation broth

2.4 失重率比較

以接入兩種方法保存的活化態(tài)菌液組為試驗(yàn)組，不添加菌液組為對(duì)照組，加入一定量的苧麻發(fā)酵10.5 h，取出苧麻，測其質(zhì)量，并計(jì)算失重率，結(jié)果如表1所示。抽真空法保存3年、10年的菌株處理的苧麻失重率分別為27.37%和27.10%（苧麻膠質(zhì)含量一般為25%～35%），基本達(dá)到了苧麻脫膠效果。而甘油冷凍法保存3年菌株及對(duì)照組的失重率分別為19.53%、13.23%，均低于苧麻膠質(zhì)含量范圍。說明抽真空法可保持菌株的高效脫膠性能，且不隨保存時(shí)間延長而明顯降低。

表1 苧麻失重率測定結(jié)果Tab.1 Weight loss during degumming

3 結(jié)論

采用抽真空法和甘油冷凍法保存的高效脫膠菌株CXJZU－120，經(jīng)活化后接種到苧麻上進(jìn)行脫膠性能比較，結(jié)果如下：

（1）抽真空法保存3年、10年的高效脫膠菌株加入活化培養(yǎng)基活化培養(yǎng)10 h后，取樣鏡檢，均能觀測到顏色較深的菌體。活化態(tài)菌液接種到苧麻上發(fā)酵10.5 h的活菌數(shù)達(dá)到1.02×109cfu／mL以上，苧麻纖維完全分散，質(zhì)量減少27%以上。COD均隨發(fā)酵時(shí)間的延長大幅度增加，表明菌株活性保存完好。

抽真空法保存10年的菌株可不用轉(zhuǎn)代，容易活化，性能穩(wěn)定，操作與技術(shù)難度不大，適合中、長期保存。

（2）甘油冷凍法保存3年的高效菌株經(jīng)活化培養(yǎng)10 h進(jìn)行鏡檢，菌體顏色深淺不一。盡管發(fā)酵液活菌數(shù)、COD均隨發(fā)酵時(shí)間的延長而增加，但變化緩慢，10.5 h的苧麻質(zhì)量僅減少19.53%，尚未全部脫膠。

甘油冷凍法雖配方簡單，操作容易，時(shí)間耗費(fèi)少，但活化時(shí)間和要求難以掌握，只適合短期保存。

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