吳志明，鹿承建，楊 勇，龍 悅，章帥文，劉 群，李昆太

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院/江西省農(nóng)業(yè)微生物資源開發(fā)與利用工程實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330045)

水稻是全球超60%人口的重要糧食作物，但由真菌、細(xì)菌和病毒引發(fā)的植物病害正嚴(yán)重威脅著世界糧食安全[1]。例如，由稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)和紋枯病菌(Rhizoctoniasolani)而引發(fā)的水稻稻瘟病和紋枯病，已成為全球性的水稻病害[2]。然而，以人類健康和生態(tài)環(huán)境為代價(jià)的化學(xué)防治仍然是控制植物病害的主要手段。生物防治技術(shù)因良好的環(huán)境兼容與可持續(xù)性，被公認(rèn)為現(xiàn)代防治植物病害的重要途徑[3]。迄今為止，細(xì)菌、真菌和放線菌等拮抗微生物已成為生物防治的主力軍，它們能通過直接產(chǎn)生抗生素、溶解酶或與病原真菌競爭營養(yǎng)和空間，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性發(fā)揮生防作用[4-6]。其中，誘導(dǎo)抗性(induced resistance,IR)是指利用生物或非生物因子刺激植物，激活其對逆境和病蟲害的天然防御系統(tǒng)，誘導(dǎo)防御相關(guān)基因產(chǎn)物的形成[7]。比如，過氧化物酶(peroxidase，POD)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)可催化木質(zhì)素的形成，苯丙氨酸解氨酶(phenylalnine ammonialyase,PAL)參與植物防御素和酚類化合物的合成，β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-glucanases,PR-2家族)和幾丁質(zhì)酶(chitinases,PR-3家族)等病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related proteins,PRs)可將病原真菌細(xì)胞壁降解并產(chǎn)生低聚物，進(jìn)而誘導(dǎo)植物啟動多種防御機(jī)制[8]。據(jù)報(bào)道，鏈霉菌可通過產(chǎn)多種次級代謝物拮抗病原菌，刺激植物啟動防御系統(tǒng)，進(jìn)而誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性[9]。有研究發(fā)現(xiàn)[10]，經(jīng)鏈霉菌MBR-37和 MBR-38處理后的杜鵑花能通過苯丙烷代謝途徑激活防御反應(yīng)，促進(jìn)花青素的積累，降低感病指數(shù)。Zhao等[11]的研究表明，鏈霉菌HD-087發(fā)酵液不僅能直接抑制黃瓜枯萎病菌菌絲生長，增加胞內(nèi)丙二醛含量，而且能有效提高黃瓜葉片的葉綠素與可溶性總糖的含量，顯著激活POD、PAL和β-1,3葡聚糖酶的酶活，降低葉片的相對電導(dǎo)率。

Streptomycessp.N2是課題組Xu等[12]分離篩選到的一株能產(chǎn)新型抗真菌活性物質(zhì)(3-甲基-3,5-氨基-4-烯-吡喃-2-酮，分子式為C6H7O2N，暫命名為農(nóng)抗N2)的新種，此活性物質(zhì)對立枯絲核菌、意大利青霉(Penicilliumitalicum)和稻瘟病菌等多種植物病原真菌具有較強(qiáng)的抑制作用。本試驗(yàn)擬通過研究不同濃度農(nóng)抗N2粗提物對水稻幼苗葉片活性氧清除系統(tǒng)、酚類物質(zhì)代謝和病程相關(guān)蛋白等抗性相關(guān)生理因子的影響，旨在探明新型農(nóng)抗N2粗提物誘導(dǎo)水稻幼苗提高抗性的作用機(jī)理，為新型微生物誘導(dǎo)劑——農(nóng)抗N2的應(yīng)用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及其處理

鏈霉菌N2(Streptomycessp.N2)，分離自云南省昆明市西山國際森林公園。參考吳志明[13]等的方法制備鏈霉菌N2粗提物。用3%NaClO對淮兩優(yōu)608水稻種子表面消毒90 s，無菌水沖洗3～5次，30 ℃浸種24 h、催芽48 h后播種于育秧盆中，待長至三葉一心期時連根拔起，用流水沖凈后浸于濃度為0.72,1.44,2.88 μg/mL的N2粗提物中，分別在處理24,48,60,72,96 h后取樣，以等量無菌水處理為對照。

1.2 鏈霉菌N2粗提物對水稻的生物防效

1.2.1 N2粗提物對離體水稻的生物防效 用滅菌剪刀剪取健康且生理部位一致的50 d稻齡葉片，經(jīng)不同濃度的N2粗提物浸泡15 min后，分別接種培養(yǎng)好的水稻紋枯病菌(Φ9 mm)；以未經(jīng)粗提物浸泡只接種菌塊為CK對照組，每個處理重復(fù)3次；30 ℃下光照培養(yǎng)2 d，參考文獻(xiàn)[14]根據(jù)紋枯病斑占水稻葉片的面積比例將感病水稻分為0～4級(0級，葉片健康無癥狀；1級：1%～25%葉片發(fā)??；2級：26%～50%葉片發(fā)??；3級：51%～75%葉片發(fā)??；4級：76%以上葉片黃化，水漬狀枯黃、潰爛)，統(tǒng)計(jì)發(fā)病情況，并按公式計(jì)算離體水稻葉片的病情指數(shù)。

病情指數(shù)=∑(病級葉片數(shù)×代表數(shù)值)/(葉片總數(shù)×發(fā)病最高級的代表數(shù)值)

(1)

1.2.2 農(nóng)抗N2粗提物對活體水稻的生物防治 在盆栽水稻生長至第50天時(2株/盆)，預(yù)防實(shí)驗(yàn)中每隔12 h將不同濃度的N2粗提物(含0.05%吐溫80)均勻噴施到水稻植株上，至有水珠流下為止，共噴施2次；24 h后將5 g培養(yǎng)好的紋枯病菌菌核均勻撒于水稻植株基部；治療實(shí)驗(yàn)中參照預(yù)防實(shí)驗(yàn)先接種紋枯病菌核，24 h后噴藥。以上實(shí)驗(yàn)組均置于濕度為80%的玻璃房(白天28 ℃；晚上20 ℃)中培養(yǎng)，以噴施蒸餾水為對照，15 d后觀察水稻感病情況。

1.3 水稻抗病性相關(guān)生理指標(biāo)的測定

1.3.1 N2粗提物對水稻幼苗活性氧清除系統(tǒng)的影響 采用羥胺氧化法[15]測定超氧陰離子自由基(·O2-)的含量，并稍有改進(jìn)；按公式

·O2-含量(nmoL/g)=(n×VT/V1)/mFW

(2)

計(jì)算每克鮮質(zhì)量樣品每小時產(chǎn)生·O2-的含量；(其中：n為標(biāo)曲計(jì)算所得NO2-的濃度/nmoL/L，VT為樣品提取液總體積/mL，V1為測定時樣品提取液體積/mL，mFW為樣品鮮質(zhì)量/g)。 采用二甲酚橙法[16]測定過氧化氫(H2O2)的含量，并稍有改進(jìn)；按公式

H2O2(mmoL/g FW)=(n×VT×Vc /V1)/(mFW×1000)

(3)

計(jì)算每克鮮質(zhì)量樣品中所含H2O2的量；(其中：n為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查的樣品H2O2濃度，μmoL/L，V1為測定時樣品提取液體積/mL，VT為樣品提取液總體積/mL，Vc為萃取時取樣體積，mFW為鮮質(zhì)量/g)。 采用分光光度法[17-18]測定POD、CAT 和SOD的酶活，并稍有改進(jìn)；以每分鐘吸光值變化0.01為1個POD和CAT酶活單位，以抑制 NBT光還原50%為一個SOD酶活性單位U，酶活單位均為U/g FW。

1.3.2 N2粗提物對水稻幼苗酚類物質(zhì)代謝的影響 采用Folin-Ciocalteu比色法[19]測定可溶性總酚含量，并稍有改進(jìn)；并按公式

C(μg/g FW)= (A×V1)/(mFW×V2)

(4)

計(jì)算每克鮮質(zhì)量樣品中所含總酚的量(其中：V1為提取時樣液體積/mL，V2為測定時樣液用量/mL，mFW為樣品鮮質(zhì)量/g，A為標(biāo)曲換算物質(zhì)量/μg)。PPO和PAL參考文獻(xiàn)[20]進(jìn)行測定，以每分鐘吸光值變化0.01為1個酶活單位U/g FW。

1.3.3 N2粗提物對水稻幼苗病程相關(guān)蛋白的影響 采用考馬斯亮藍(lán)法測定可溶性總蛋白含量mg/g FW。參考文獻(xiàn)[21-22]測定幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以每小時分解膠體幾丁質(zhì)產(chǎn)生1 μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量定義為一個幾丁質(zhì)酶活單位U/g FW，以每小時分解昆布多糖產(chǎn)生100 μg葡萄糖的酶量為一個活性單位U/g FW。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Excel 2010、DPS 7.05、Adobe Photoshop CS5和Origin 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、繪圖及顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 N2粗提物對水稻的生物防效

觀察不同處理組間的離體水稻發(fā)現(xiàn)(圖1A)，隨著N2粗提物濃度的提高，離體水稻葉片上的病斑逐漸減少，CK葉片受紋枯病的嚴(yán)重侵染，出現(xiàn)大面積水漬狀病斑，而11.53 μg/mL組僅出現(xiàn)菌絲，未見病斑；同時，11.53 μg/mL中0級感病葉片數(shù)占同組處理葉片總數(shù)的56.56%，明顯高于CK(圖1B)；且N2粗提物處理后明顯降低了離體葉片的病情指數(shù)，各組病情指數(shù)分別為80.56%、72.22%、47.22%、38.89%和30.56%(圖1C)。此外，經(jīng)N2粗提物預(yù)防和治療處理后，活體水稻上紋枯病斑明顯減少，且濃度越高防治效果越佳(圖2)。由此可見，鏈霉菌N2粗提物可有效防止水稻紋枯病菌感染水稻。

2.2 N2粗提物對水稻幼苗活性氧清除系統(tǒng)的影響

由圖3可知，不同濃度N2粗提物處理后水稻幼苗中·O2-和H2O2的含量均明顯下降，變化趨勢一致，經(jīng)1.44和2.88 μg/mL處理48 h后·O2-含量顯著降低了37.24%與30.50%，此時H2O2含量相比CK減少了19.40%和16.42%；直至96 h·O2-含量仍較CK組差異顯著。此外，SOD隨時間的延長活性先降后升，48 h后各處理組酶活開始顯著被激活，于72 h時分別提高了37.98%、40.57和84.96%，顯著高于CK組(圖4A)；CAT雖經(jīng)N2粗提物誘導(dǎo)后得到有效增強(qiáng)，但相比CK并不顯著(圖4B)；POD則迅速增強(qiáng)，且在72 h時相比CK顯著提高了78.06%(圖4C)。由此可見，水稻幼苗經(jīng)N2粗提物處理后，迅速激活了SOD、CAT和POD酶的活性，體內(nèi)·O2-和H2O2等活性氧含量被有效清除，減緩了水稻幼苗的氧化損傷，且高濃度處理持續(xù)效果相對更穩(wěn)定。

圖A中黑色箭頭為典型紋枯病病斑，白色箭頭為紋枯病菌絲，圖B為感病級數(shù)百分比，圖C為病情指數(shù)The black arrows in figure A is a typical disease lesion and the white arrow is referred to as the mycelium of the sheath blight，figure B as a percentage of the progression of a sense of disease,figure C is the disease index圖1 農(nóng)抗N2粗提物對離體水稻葉片的生物防效Fig.1 The degree of AN2 crude extract on detached rice leaves infected with sheath bligh

圖中圓圈為典型紋枯病病斑，箭頭所指為紋枯病菌核The circle in figure is typical of sheath blight lesion and the arrow refers to the nucleus of the Rhizoctonia solani圖2 農(nóng)抗N2粗提物對活體水稻的生物防治Fig.2 The infection of living-leaves by different concentration of AN2 crude extract

圖中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；圖中“*”表示經(jīng) Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)在同一時間點(diǎn)處理組與CK組間差異顯著(P<0.05)，下同The results were means±SD (standard deviation) of triplicate determinations,the asterisk “*” in the same line indicate the significant (P<0.05) differences among treatments,similarly hereinafter 圖3 農(nóng)抗N2粗提物對水稻幼苗活性氧含量的影響Fig.3 Effect of AN2 crude extract on active oxygen content of rice

A：超氧化物歧化酶SOD；B：過氧化氫酶CAT；C：過氧化物酶PODA：Superoxide dismutase (SOD)，B：Catalase(CAT)，C：Peroxidase(POD)圖4 農(nóng)抗N2粗提物對水稻幼苗抗氧化酶活性的影響Fig.4 Effect of AN2 crude extract on antioxidant enzyme activities of rice

2.3 N2粗提物對水稻幼苗酚類物質(zhì)代謝的影響

由圖5可知，水稻幼苗經(jīng)不同濃度N2粗提物處理后酚類物質(zhì)代謝能力相比CK均顯著提高，其中2.88 μg/mL組中的PPO(圖5A)、總酚含量(圖5B)和PAL(圖5C)活性分別在72，48，24 h時達(dá)最大值，相比對照組分別提高了47.20%、43.55%和311.11%；相比2.88 μg/mL處理組，1.44 μg/mL處理與CK的變化趨勢更一致，PAL、PPO活性和總酚含量在72h時分別高達(dá)(0.36±0.06)、(8.39±0.49)U/(g·min)和127.96±8.54 μg/g FW，差異顯著。由此可見1.44 μg/mL N2粗提物能顯著增強(qiáng)酚類物質(zhì)代謝相關(guān)酶的活性，促進(jìn)生物活性物質(zhì)的產(chǎn)生，延緩水稻幼苗各項(xiàng)生理功能的衰弱，且其作用效果持續(xù)穩(wěn)定，進(jìn)一步提高了水稻的抗病性。

2.4 N2粗提物對水稻幼苗抗病相關(guān)蛋白的影響

由圖6A可知，水稻幼苗中可溶性蛋白質(zhì)的含量隨時間的延長先略有降低后逐漸升高，48 h時各處理組的蛋白含量分別為(1.83±0.05)、(2.70±0.08)、(2.43±0.05)、(3.17±0.03)mg/g FW，且48 h至72 h間均顯著高于CK組；同時由圖6B可見，經(jīng)1.44和2.88 μg/mL N2粗提物處理后幾丁質(zhì)酶活自24 h后逐漸提高，至96 h時相較CK分別提高了21.92%和30.80%，且差異顯著；此外，β-1,3葡聚糖酶隨處理時間的延長先升高后降低，在48 h時達(dá)最大，且濃度越高酶活越強(qiáng)(圖6C),其中1.44和2.88 μg/mL與CK差異顯著。綜上可知，適宜濃度的N2粗提物能有效激活β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶等抗性相關(guān)酶活性，促進(jìn)體內(nèi)蛋白增加，以此增強(qiáng)水稻幼苗的抗病害能力，在48 h左右最強(qiáng)。

A：多酚氧化酶PPO；B：可溶性總酚；C：苯丙氨酸解氨酶PAL。圖中數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；圖中不同小寫字母表示經(jīng) Duncan氏新復(fù)極差法檢驗(yàn)在同一時間點(diǎn)各處理組間差異顯著(P<0.05)，下同A：Polyphenoloxidase (PPO)，B：Soluble total phenol，C：Phenylalnine ammonialyase(PAL).The results were means±SD(standard deviation) of triplicate determinations,the different lowercase letters in the same line indicate the significant (P<0.05) differences among treatments,similarly hereinafter圖5 農(nóng)抗N2粗提物對水稻幼苗酚類物質(zhì)代謝的影響Fig.5 Effects of AN2 crude extract on metabolism of phenolic compounds in rice seedlings

A：可溶性蛋白；B：幾丁質(zhì)酶；C：β-1,3葡聚糖酶A：Soluble protein，B：Chitinase，C：β-1,3-glucanase圖6 農(nóng)抗N2粗提物對水稻幼苗抗性相關(guān)蛋白的影響Fig.6 Effect of AN2 crude extract on chitinase、β-1,3-glucanase and protein content of rice

3 討 論

由立枯絲核菌引發(fā)的水稻紋枯病菌因宿主廣泛，菌核長期存活于兩季作物土壤中，且遺傳變異性極強(qiáng)，致使水稻產(chǎn)量和質(zhì)量大幅降低[23]。近年來，國內(nèi)外研究者利用鏈霉菌防治水稻紋枯病的應(yīng)用研究越來越多[24-25]。生防試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，11.53 μg/mL N2粗提物能顯著抑制紋枯病菌在水稻葉片上形成菌核，降低水稻感染紋枯病的程度。超氧陰離子自由基(·O2-)和過氧化氫(H2O2)是生物體內(nèi)活性氧ROS的重要組成部分，正常情況下，胞內(nèi)ROS維持著相對穩(wěn)定的平衡，當(dāng)受到逆境、機(jī)體損傷等外界環(huán)境脅迫后ROS生產(chǎn)量超出自身清除能力，就會造成ROS水平升高，引起氧化應(yīng)激[25-26]。而 SOD，CAT與POD三者協(xié)調(diào)組成的活性氧清除系統(tǒng)能有效清除植物體內(nèi)的活性氧[27]。本試驗(yàn)表明，N2粗提物處理能迅速誘導(dǎo)激活SOD，CAT與POD組成的活性氧清除系統(tǒng)，防止水稻幼苗因·O2-和 H2O2含量過高而造成氧化損傷，且1.44和2.88 μg/mL處理組相比CK與0.72 μg/mL處理組效果更為明顯。

PAL主要通過非氧化脫氨基作用將苯丙氨酸催化成反式肉桂醛，是酚類化合物積累的關(guān)鍵酶[28]。同時，PPO可參與苯丙烷類衍生物代謝以及類黃酮和生物堿的合成等生理生化過程，將酚類物質(zhì)氧化形成高毒性的醌類物質(zhì)抵御病原菌的入侵[29]。幾丁質(zhì)酶和β-1,3葡聚糖酶是PRs蛋白家族中的重要成員，PRs蛋白在健康植物中不存在或表現(xiàn)微弱，當(dāng)被誘導(dǎo)后則迅速產(chǎn)生并積累，因此認(rèn)為大多誘導(dǎo)產(chǎn)生的植物抗性均與PRs蛋白有關(guān)，它參與植物的局部和系統(tǒng)誘導(dǎo)抗性[11,30]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2.88 μg/mL N2粗提物處理水稻幼苗24 h后顯著激活了PAL的活性，促進(jìn)了總酚含量的積累，在48 h達(dá)到最高，隨后誘導(dǎo)PPO酶活在72 h時最高，促使其充分將酚類物質(zhì)進(jìn)一步氧化成醌類物質(zhì)，進(jìn)而顯著提高水稻幼苗的抗性。同時，可溶性總蛋白、幾丁質(zhì)酶和β-1,3葡聚糖酶活等病程相關(guān)蛋白均顯著高于CK組，進(jìn)一步提升了水稻幼苗降解病原真菌細(xì)胞壁的能力，有利于誘導(dǎo)植物啟動防御機(jī)制。

綜上所述，適宜濃度的N2粗提物可同時激活水稻幼苗活性氧清除系統(tǒng)，促進(jìn)酚類物質(zhì)代謝，增加病程相關(guān)蛋白含量等多種防御機(jī)制，協(xié)同提高水稻幼苗的抗性。但此研究局限于非生物因子誘導(dǎo)和酶活的測定，且是否為抗真菌活性物質(zhì)農(nóng)抗N2起主要誘導(dǎo)作用還有待進(jìn)一步探索。同時，植物的誘導(dǎo)抗性并非單一因素作用，而是一項(xiàng)系統(tǒng)工程。因此農(nóng)抗N2誘導(dǎo)植物抗病的作用機(jī)制有待更系統(tǒng)的研究。

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