楊 樂(lè)，江武軍，史晶亮，何旭江，曾志將

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 蜜蜂研究所，江西 南昌 330045)

蜜蜂是一種真社會(huì)性昆蟲(chóng)，擁有一套完善、精細(xì)的語(yǔ)言通訊系統(tǒng)，是群體與個(gè)體能夠正常生長(zhǎng)、發(fā)育與繁衍的重要保證?；瘜W(xué)信息素對(duì)蜜蜂尤為重要，常見(jiàn)的蜜蜂信息素有蜂王信息素、工蜂信息素、雄蜂信息素和蜜蜂子脾信息素[1]。其中蜂王上顎腺信息素又稱蜂王物質(zhì)[2]。蜂王上顎腺信息素由蜜蜂蜂王上顎腺產(chǎn)生，可以調(diào)控工蜂行為、提高工蜂采集積極性、抑制工蜂卵巢發(fā)育，同時(shí)也是性引誘劑，誘使雄蜂追蹤和發(fā)情[3]。

蜂王上顎腺信息素的研究經(jīng)歷了一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程。1954年Butler預(yù)測(cè)工蜂能從蜂王體表獲得一種“蜂王物質(zhì)”，并通過(guò)工蜂間的相互飼喂行為傳遞這種蜂王物質(zhì)，進(jìn)而達(dá)到控制蜂群的目的。1957年他第一次從蜂王頭部成功提取到蜂王物質(zhì)，隨后又證明了蜂王物質(zhì)是通過(guò)蜂王上顎腺產(chǎn)生的，因此稱為蜂王上顎腺信息素。20世紀(jì)60年代，人們先后從蜂王上顎腺信息素中鑒定并分離出反式-9-氧代-2-癸烯酸(9-ODA)和反式-9-羥基-2-癸烯酸(-9-HDA)。1992年Winston和Slessor[4]在西方蜜蜂蜂王上顎腺信息素中又鑒定出另外3種成分：順式-9-羥基-2-癸烯酸(+9-HDA)、對(duì)羥基苯甲酸甲酯(HOB)以及4-羥基-3-甲氧苯基乙醇(HVA)。1997年P(guān)lettner等[5]發(fā)現(xiàn)東方蜜蜂蜂王上顎腺信息素中只含有4種成分：9-ODA、+9-HDA、-9-HDA和HOB，不含HVA。2003年Keeling等[6]又從西方蜜蜂蜂王上顎腺信息素中鑒定出另外4種新成分：松柏醇(CA)、甲基油酸鹽(MO)、十六烷-1-醇(PA)和亞麻酸(LEA)。這些信息素總稱為“蜂王上顎腺信息素”或“蜂王物質(zhì)”。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，蜂王上顎腺信息素最初作為性信息素吸引雄蜂交尾，隨著不斷的進(jìn)化，也具有了調(diào)節(jié)蜂群內(nèi)工蜂社會(huì)行為的作用[7-8]。

雄蜂的主要作用就是與蜂王交配[9]。在晴朗無(wú)風(fēng)的午后，性成熟雄蜂開(kāi)始進(jìn)行婚飛，每次平均持續(xù)大約25～32 min。雄蜂婚飛的一個(gè)特征是成百上千只雄蜂聚集在一起，形成“雄蜂云”，也叫雄蜂聚集區(qū)，多個(gè)蜂群的雄蜂會(huì)聚集在雄蜂聚集區(qū)與蜂王進(jìn)行交尾[1]。通過(guò)對(duì)蜂王釋放的蜂王上顎腺信息素的感知，雄蜂可以快速找到并追逐蜂王，完成交配[10]。1993年Loper等[11]使用雷達(dá)系統(tǒng)探測(cè)到9-ODA能吸引到800 m以外的雄蜂，充分顯示了蜂王上顎腺信息素對(duì)雄蜂極強(qiáng)的吸引效果。

上述的蜂王上顎腺信息素對(duì)雄蜂的吸引效應(yīng)主要集中在西方蜜蜂上，在中華蜜蜂方面鮮有研究報(bào)道。中華蜜蜂是我國(guó)的重要蜂種，對(duì)我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)平衡起著重要作用。自西方蜜蜂引進(jìn)我國(guó)之后，中華蜜蜂的數(shù)量顯著下降。其中原因之一即是西方蜜蜂對(duì)中華蜜蜂處女王交尾行為的干擾。2種蜜蜂蜂王上顎腺信息素成分相近[12]，且他們的處女王婚飛時(shí)間和雄蜂出游時(shí)間基本一致。因此當(dāng)中華蜜蜂處女王婚飛時(shí)，能吸引大量西方蜜蜂雄蜂與其接觸甚至?xí)霈F(xiàn)抱對(duì)的“交尾行為”(無(wú)效交尾)，這使得中華蜜蜂處女王交尾成功率大大下降[13]。本研究從生物學(xué)角度出發(fā)，并利用行為學(xué)觀測(cè)方法研究不同濃度的3種蜂王上顎腺信息素成分對(duì)中華蜜蜂巢門口以及巢脾上雄蜂的吸引力，以期為西方蜜蜂雄蜂干擾中蜂蜂王交尾現(xiàn)象提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蜜蜂

試驗(yàn)所用雄蜂取自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所飼養(yǎng)的健康中華蜜蜂(Apisceranacerana)。

1.2 主要試劑

9-ODA、HOB、HVA(純度均>95%)購(gòu)自長(zhǎng)沙奧百斯特科技有限公司；蜂蠟巢礎(chǔ)購(gòu)自上饒市精益蜂具有限公司；二氯甲烷購(gòu)自天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；濾紙購(gòu)自杭州特種紙業(yè)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備 參照譚墾等[14]的試驗(yàn)方法，利用二氯甲烷將9-ODA、HOB、HVA均稀釋為1 μg/μL、10 μg/μL、100 μg/μL。稀釋后的蜂王上顎腺信息素溶液裝入棕色樣品瓶?jī)?nèi)，并用密封帶封閉瓶口。

將蜂蠟巢礎(chǔ)(41 cm×19.5 cm)裝入有機(jī)玻璃盒(41 cm×19.5 cm)內(nèi)，用圓規(guī)在巢礎(chǔ)最中心位置畫(huà)出1個(gè)直徑為4 cm的圓作為蜜蜂放置區(qū)。在巢礎(chǔ)2端1/4的位置分別用昆蟲(chóng)釘固定2片濾紙(2 cm×0.8 cm)作為對(duì)照組和試驗(yàn)組。試驗(yàn)示意圖見(jiàn)圖1。為避免蜂蠟巢礎(chǔ)中揮發(fā)性物質(zhì)的干擾，本試驗(yàn)所用到的蜂蠟巢礎(chǔ)均已在室溫放置1年以上。

1.3.2 樣品采集 根據(jù)雄蜂的出游飛行習(xí)慣[15]，在晴朗無(wú)風(fēng)的09:30—11:30進(jìn)行巢脾上雄蜂的試驗(yàn)，小心在巢脾上抓取行動(dòng)敏捷、腹部堅(jiān)實(shí)的中蜂雄蜂；14:30—16:30進(jìn)行巢門口雄蜂的試驗(yàn)，在巢門口抓取飛行歸巢的中蜂雄蜂。每次抓捕30只作為1組，小心放于燒杯內(nèi)防止其逃跑。

圖1 實(shí)驗(yàn)所用蜂蠟巢礎(chǔ)示意圖Fig.1 The picture of the beeswax foundation used in the expressions

1.3.3 3種不同濃度的蜂王上顎腺信息素對(duì)雄蜂的吸引效果 打開(kāi)有機(jī)玻璃盒，用移液槍分別吸取1 μL蜂王上顎腺信息素溶液和二氯甲烷加入試驗(yàn)組和對(duì)照組。使用CO2將蜜蜂簡(jiǎn)單麻醉5 s，立即放于蜜蜂放置區(qū)，隨后關(guān)閉有機(jī)玻璃盒。待蜜蜂蘇醒后，開(kāi)始數(shù)5 min內(nèi)雄蜂接觸試驗(yàn)組和對(duì)照組濾紙的次數(shù)。為了防止偏向性，每個(gè)實(shí)驗(yàn)之間都交換對(duì)照組和試驗(yàn)組，每交換1次作為1個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)。最后將(2次雄蜂接觸試驗(yàn)組濾紙的次數(shù)-2次雄蜂接觸對(duì)照組濾紙的次數(shù))的結(jié)果記錄下來(lái)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)用3群中蜂雄蜂做3次重復(fù)來(lái)測(cè)試1種成分的1個(gè)濃度。每次試驗(yàn)結(jié)束都需要更換蜂蠟巢礎(chǔ)和濾紙條，并重新滴加蜂王上顎腺信息素溶液。

1.3.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用StatView 5.01軟件對(duì)各樣品進(jìn)行顯著性差異分析(P<0.05，LSD多重比較)，并通過(guò)GraphPad Prism5.2軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 巢門口中蜂雄蜂對(duì)不同濃度9-ODA的選擇

結(jié)果如圖2所示，巢門口中蜂雄蜂對(duì)于10 μg/μL組的選擇顯著高于1 μg/μL組(P<0.05)；100 μg/μL組與其余2組的差異均不顯著(P>0.05)。

圖2 巢門口雄蜂對(duì)不同濃度9-ODA的選擇次數(shù)Fig.2 The choice times of drones captured at hive entrance to the different doses of 9-ODA

圖3 巢脾上雄蜂對(duì)不同濃度9-ODA的選擇次數(shù)Fig.3 The choice times of drones captured at frames in hive to the different doses of 9-ODA

2.2 巢脾上中蜂雄蜂對(duì)不同濃度9-ODA的選擇

結(jié)果如圖3所示，巢脾上中蜂雄蜂對(duì)不同濃度9-ODA的選擇差異均不顯著(P>0.05)。

2.3 巢門口中蜂雄蜂對(duì)不同濃度HOB的選擇

結(jié)果如圖4所示，巢門口中蜂雄蜂對(duì)于1 μg/μL組的選擇次數(shù)顯著高于10 μg/μL組和100 μg/μL組(P<0.05)，但10 μg/μL組和100 μg/μL組的選擇差異不顯著(P>0.05)。

2.4 巢脾上中蜂雄蜂對(duì)不同濃度HOB的選擇

結(jié)果如圖5所示，巢脾上中蜂雄蜂對(duì)不同濃度HOB的選擇差異均不顯著(P>0.05)。

圖4 巢門口雄蜂對(duì)不同濃度HOB的選擇次數(shù)Fig.4 The choice times of drones captured at hive entrance to the different doses of HOB

圖5 巢脾上雄蜂對(duì)不同濃度HOB的選擇次數(shù)Fig.5 The choice times of drones captured at frames in hive to the different doses of HOB

2.5 巢門口中蜂雄蜂對(duì)不同濃度HVA的選擇

結(jié)果如圖6所示，中蜂雄蜂對(duì)于10 μg/μL組和100 μg/μL組HVA的選擇顯著高于1 μg/μL組(P<0.05)，但10 μg/μL組與100 μg/μL組的選擇差異不顯著(P>0.05)。

2.6 巢脾上中蜂雄蜂對(duì)不同濃度HVA的選擇

結(jié)果如圖7所示，巢脾上中蜂雄蜂對(duì)不同濃度HVA的選擇差異均不顯著(P>0.05)

圖6 巢門口雄蜂對(duì)不同濃度HVA的選擇次數(shù)Fig.6 The choice times of drones captured at hive entrance to the different doses of HVA

圖7 巢脾上雄蜂對(duì)不同濃度HVA的選擇次數(shù)Fig.7 The choice times of drones captured at frames in hive to the different doses of HVA

3 討 論

9-ODA是蜂王上顎腺信息素的主要成分，且是多種成分中唯一1種長(zhǎng)距離性信息素[16]。本研究發(fā)現(xiàn)10 μg/μL的9-ODA對(duì)巢門口雄蜂的吸引力顯著高于1 μg/μL組(P<0.05)。前人研究證明0.1當(dāng)量濃度的9-ODA足以吸引大量西方蜜蜂雄蜂[17]。0.1當(dāng)量濃度的9-ODA相當(dāng)于18.4 μg/μL，這與本研究的結(jié)果基本一致。

Slessor等[18]發(fā)現(xiàn)HOB能作為性引誘劑，引誘西方蜜蜂雄蜂與處女王交尾。本研究發(fā)現(xiàn)1 μg/μL的HOB對(duì)于巢門口中蜂雄蜂的吸引力顯著高于10 μg/μL組和100 μg/μL組，表明HOB對(duì)于中蜂雄蜂同樣具有吸引力。另外，有研究發(fā)現(xiàn)在中蜂蜂王體內(nèi)HOB的含量低于9-ODA和9-HDA[19]，且Plettner等[20]發(fā)現(xiàn)處女王體內(nèi)HOB含量低于產(chǎn)卵蜂王。筆者推測(cè)高濃度HOB可能對(duì)中蜂雄蜂的吸引存在抑制作用。

HVA對(duì)西方蜜蜂雄蜂具有吸引力[21]。由于中蜂蜂王上顎腺信息素中不含HVA，所以HVA對(duì)中蜂雄蜂的作用沒(méi)有研究報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)10 μg/μL和100 μg/μL的HVA對(duì)巢門口雄蜂的吸引力顯著高于1 μg/μL的HVA，表明HVA對(duì)中蜂雄蜂也存在吸引作用，且隨濃度升高吸引力逐漸增強(qiáng)，但過(guò)高濃度的HVA并不能增強(qiáng)其對(duì)雄蜂的吸引力。

本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的9-ODA、HOB、HVA對(duì)于巢脾上雄蜂的吸引力均差異均不顯著。巢門口抓取的雄蜂均為婚飛后返巢的雄蜂，而在巢脾上的雄蜂并未經(jīng)過(guò)出游飛行。有研究發(fā)現(xiàn)處女王經(jīng)過(guò)飛行行為會(huì)影響其基因表達(dá)變化[22-23]，筆者推測(cè)雄蜂的飛行行為(婚飛或試飛)也可能影響其基因表達(dá)或生理變化，進(jìn)而提高了其對(duì)蜂王上顎腺信息素(9-ODA、HOB、HVA)的選擇效果。另外，處女王在婚飛過(guò)程中才與性成熟雄蜂發(fā)生交尾行為，而在巢脾上并不吸引雄蜂[1]。這與處女蜂王對(duì)群內(nèi)巢脾上雄蜂無(wú)吸引效果一致。

譚墾等[14]證明了西方蜜蜂工蜂對(duì)于蜂王上顎腺信息素主要成分的敏感性比中蜂工蜂更強(qiáng)，但到目前還沒(méi)有人系統(tǒng)比較過(guò)蜂王上顎腺信息素主要成分對(duì)中蜂雄蜂和西方蜜蜂雄蜂的選擇行為。本研究證明了9-ODA、HOB以及HVA對(duì)飛行歸巢中蜂雄蜂均存在吸引作用，同時(shí)推測(cè)中蜂雄蜂的飛行行為能增強(qiáng)其對(duì)蜂王上顎腺信息素的感知力，但有關(guān)分子機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)：高濃度雌性素有抑制雄蜂對(duì)蜂王吸引力趨向，這種現(xiàn)象是否與蜂王不在蜂群內(nèi)與雄蜂交配的生物學(xué)特性相關(guān)，也有待于進(jìn)一步探討。

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