宋 千,龐宏剛,祁 磊,梁 晨,王 拓,王 偉,郭世文*

(1西安交通大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科,西安 710061;2西安交通大學第一附屬醫(yī)院周圍血管科;*通訊作者,E-mail:gsw1962@126.com)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤,約占神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的45%,顱內(nèi)惡性腫瘤的80%[1,2]。神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞呈浸潤性生長、具有極強的侵襲性,且生長迅速,患者病情進展迅速。盡管臨床上采用手術(shù)切除聯(lián)合放、化療可在短期內(nèi)改善患者癥狀,但術(shù)后腫瘤極易復發(fā),患者死亡率高、預后較差[3-5]。近年來,針對神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關(guān)基因的研究成為目前研究的熱點。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA,雖然lncRNA并不能編碼蛋白質(zhì),但越來越多的研究發(fā)現(xiàn),lncRNA在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中均發(fā)揮了重要的調(diào)控作用[6]。近年來,在腫瘤相關(guān)的研究中表明多種lncRNA通過不同的途徑調(diào)節(jié)促癌基因或抑癌基因的功能,從而參與腫瘤的增殖、凋亡、侵襲以及遷移等生物進程[7,8]。XIST作為長鏈非編碼RNA的一種,其在腫瘤調(diào)控中的作用受到了研究者的關(guān)注。有研究證實,XIST通過靶向microRNA-137在人腦膠質(zhì)瘤中發(fā)揮致癌作用[9]。國內(nèi)學者證實,沉默XIST能夠通過靶向microRNA-185抑制膠質(zhì)瘤U87細胞增殖,從而發(fā)揮抑癌作用[10]。但XIST的表達水平與膠質(zhì)瘤患者的臨床病理特征以及預后的關(guān)系尚無文獻報道,因此,本課題組通過檢測不同級別膠質(zhì)瘤組織中XIST的表達水平,探討其與膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征和預后的相關(guān)性以及作為腫瘤標志物的可能性,從而為膠質(zhì)瘤的早期診斷及其治療提供新的靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究選取西安交通大學第一附屬醫(yī)院2010-01～2012-11期間收住院并行手術(shù)切除的64例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者,其中男性39例,女性25例,年齡22-73歲,平均47歲。根據(jù)2007年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類標準進行組織學分級:WHO Ⅰ級12例,WHO Ⅱ級14例,WHO Ⅲ級17例,WHO Ⅳ級21例。本研究中所有患者均為首次手術(shù)治療,術(shù)前均未行放療或化療,且具備完整的術(shù)后5年隨訪調(diào)查資料。入選患者自手術(shù)之日起至少每3月以門診復查或電話等方式進行術(shù)后隨訪,根據(jù)患者的具體情況,隨訪資料隨之進行更新,隨訪截止日期為2017年11月。癌旁正常腦組織來自于患者術(shù)中膠質(zhì)瘤組織旁正常的組織,手術(shù)切除的組織標本立刻儲存在-80 ℃液氮中,以備分離提取RNA。該研究獲得西安交通大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會同意,術(shù)前均簽署知情同意書。

1.2 膠質(zhì)瘤組織和癌旁正常腦組織中XIST的提取和檢測

從液氮中取出冰凍的膠質(zhì)瘤組織和癌旁正常腦組織標本,采用Trizol法(Invitrogen,CA,USA)提取樣本中的總RNA,然后采用紫外分光光度計測定樣本在波長260 nm和280 nm處的吸光度比值,計算OD 260/280,鑒定RNA的純度。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)(RT-PCR)檢測組織標本中XIST的表達水平,內(nèi)參設(shè)置為U6。引物序列如下:XIST上游引物正向:5′-AGCTCCTCGGACAGCTGTAA-3′;XIST下游引物反向:5′-CTCCAGATAGCTGGCAACC-3′。U6上游引物正向:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′;U6下游引物反向:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。采用2-ΔΔCt法對測得的數(shù)據(jù)進行相對定量分析,所有樣品至少重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 XIST在膠質(zhì)瘤組織中的表達水平明顯升高

RT-PCR檢測結(jié)果顯示,與癌旁正常腦組織相比,XIST在膠質(zhì)瘤組織中的表達水平顯著升高(1.00±0.73vs2.88±0.73,P=0.001 2)。與此同時,高級別膠質(zhì)瘤中XIST的表達水平要明顯高于低級別膠質(zhì)瘤中的表達(4.20±1.09vs2.88±0.73,P=0.013 4,見圖1)。

圖1 XIST在膠質(zhì)瘤組織和正常腦組織中的表達水平Figure 1 The expression level of XIST in normal brain tissues and glioma tissues

2.2 XIST的表達水平與膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征之間的相關(guān)性

根據(jù)XIST在所有膠質(zhì)瘤組織標本中的平均表達水平(3.67±0.83),將本研究中所有的患者分為兩組:XIST高表達組(35例,4.31±0.97),XIST低表達組(29例,3.02±0.86)。χ2檢驗分析顯示:高表達的XIST與高WHO分級(P<0.001)和低KPS評分(P=0.001)有關(guān),而與患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目等均無關(guān)(P分別為0.632,0.494,0.838,0.728,見表1)。

表1XIST表達水平與膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的相關(guān)性

Table1CorrelationbetweentheexpressionlevelofXISTandclinicopathologicalcharacteristicsingliomapatients

臨床病理特征nXIST表達水平高(n=35)低(n=29)χ2P年齡0.2290.632 <50歲311615 ≥50歲331914性別0.4670.494 男392019 女251510WHO分級17.657<0.001 Ⅰ-Ⅱ級26620 Ⅲ-Ⅳ級38299KPS評分10.2100.001 ≥80分28919 <80分362610腫瘤直徑0.0420.838 <4.5 cm341915 ≥4.5 cm301614腫瘤數(shù)目0.1210.728 單個291712 多個351916

KPS:卡氏行為狀態(tài)評分

2.3 XIST的表達水平與膠質(zhì)瘤患者預后之間的相關(guān)性

Kaplan-Meier法繪制生存曲線,Log-rank檢驗比較兩組患者的生存曲線是否有差異。結(jié)果表明,XIST高表達組患者的生存率顯著低于XIST低表達組,且差異有統(tǒng)計學意義(P=0.007,見圖2)。

單因素分析結(jié)果顯示,WHO分級增高、KPS評分<80分、XIST高表達均是影響膠質(zhì)瘤患者預后的危險因素,見表2。多因素Cox比例風險回歸模型分析結(jié)果顯示:WHO分級增高、KPS評分<80分、XIST高表達均是影響膠質(zhì)瘤患者臨床預后的獨立因素(見表3)。

3 討論

目前,在膠質(zhì)瘤的臨床診療中,現(xiàn)有的治療手段包括手術(shù)、放化療等雖然在一定程度上降低了膠質(zhì)瘤患者的死亡率,但是由于缺乏特異性的治療靶點,膠質(zhì)瘤,尤其是膠質(zhì)母細胞瘤患者術(shù)后5年生存率仍舊偏低[11,12]。因此,探索潛在的可靠的可作為早期診斷、治療和評估預后的生物學標記物,對膠質(zhì)瘤患者的診療具有很大的意義。

圖2 XIST高表達組和低表達組患者生存率的比較Figure 2 Comparison of overall survival rate in glioma patients with high XIST expression and low XIST expression

表2膠質(zhì)瘤患者不同臨床病理變量和XIST表達水平的單變量分析

Table2UnivariateanalysisofdifferentclinicopathologicalvariablesandXISTexpressioninpatientswithglioma

臨床病理特征HR(95%CI)P年齡(<50vs≥50歲)1.367(0.792-2.201)0.285性別(男vs女)0.744(0.311-1.814)0.796KPS評分(<80vs≥80)1.987(1.124-3.655)0.018WHO分級(I—II級vsIII—IV級)1.912(1.098-3.345)0.026腫瘤直徑(<4.5vs≥4.5厘米)1.207(0.714-2.145)0.539腫瘤數(shù)目(單個vs多個)1.132(0.664-2.087)0.714XIST表達水平(低vs高)2.534(1.411-4.753)0.004

KPS:卡氏行為狀態(tài)評分;HR:風險比

表3膠質(zhì)瘤患者不同臨床病理變量和XIST表達水平的多變量分析

Table3MultivariateanalysesofdifferentclinicopathologicalvariablesandXISTexpressioninpatientswithglioma

臨床病理特征HR(95%CI)P年齡(<50vs≥50歲)1.164(0.622-2.069)0.537性別(男vs女)0.892(0.393-1.967)0.842KPS評分(<80vs≥80)2.527(1.463-4.821)0.007WHO分級(I—II級vsIII—IV級)2.633(1.484-5.039)0.010腫瘤直徑(<4.5vs≥4.5厘米)0.894(0.502-1.608)0.621腫瘤數(shù)目(單個vs多個)1.022(0.603-1.857)0.788XIST表達水平(低vs高)3.386(1.965-6.127)<0.001

KPS:卡氏行為狀態(tài)評分

越來越多的研究證據(jù)表明,lncRNA可能涉及多種生物和病理活動,包括細胞增殖、分化、遷移、凋亡、細胞周期等,從而在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮促癌或抑癌作用。此外,也有研究證實很多l(xiāng)ncRNAs與腫瘤患者的臨床預后密切相關(guān)。例如過表達的lncRNA-LINC00673與舌鱗狀細胞癌患者的預后不良具有顯著相關(guān)性[13];食管鱗狀細胞癌組織中上調(diào)的lncRNA-FOXD2-AS1預示著患者的預后不佳[14];表達下調(diào)的lncRNA-LOC389332與腎細胞癌患者的不良預后密切相關(guān)[15]。然而,到目前為止,只有少數(shù)lncRNA被報道可作為預測膠質(zhì)瘤患者預后的獨立因素。

XIST是目前研究較多的一種lncRNA,異常表達的XIST參與調(diào)節(jié)了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。有研究發(fā)現(xiàn)XIST通過對miR-101/EZH2的促進食管鱗狀細胞癌的惡性腫瘤[16]。也有研究證實XIST在人非小細胞肺癌組織和細胞中表達異常增高,下調(diào)XIST的表達可抑制癌細胞的增殖和侵襲,誘導細胞凋亡,同時在體內(nèi)實驗條件下抑制皮下腫瘤生長[17]。XIST在膠質(zhì)瘤中的作用也有研究報道。有研究發(fā)現(xiàn)XIST在血-腫瘤屏障通透性和膠質(zhì)瘤血管生成中起著關(guān)鍵作用,抑制XIST的表達可能是膠質(zhì)瘤臨床治療的潛在靶點[18]。也有文獻報道,XIST在膠質(zhì)瘤細胞中的表達顯著增高,下調(diào)XIST的表達通過與microRNA-429相互作用抑制了腫瘤的侵襲性以及促血管生成能力,表明XIST可能作為治療膠質(zhì)瘤的潛在靶點[19]。然而,到目前為止,XIST評估膠質(zhì)瘤患者的臨床預后價值卻沒有文獻報道。因此,本課題組通過檢測XIST在膠質(zhì)瘤組織中的表達水平,探討其與膠質(zhì)瘤患者預后的關(guān)系。

本研究中,我們首先檢測XIST在膠質(zhì)瘤組織和癌旁正常腦組織中的表達水平,RT-PCR分析結(jié)果顯示XIST在膠質(zhì)瘤組織中的表達水平顯著高于癌旁正常腦組織,并且XIST的表達水平隨著膠質(zhì)瘤的WHO分級的增高而增加。隨后,探討了XIST的表達水平與膠質(zhì)瘤患者多項臨床病理特征之間的相關(guān)性。χ2檢驗分析顯示:高表達的XIST與高WHO分級和低KPS評分具有顯著相關(guān)性,而與患者年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤數(shù)目等均無關(guān)。而且Kaplan-Meier分析結(jié)果表明,XIST高表達組患者的生存率顯著低于XIST低表達組。最后研究結(jié)果顯示W(wǎng)HO分級增高、KPS評分<80分、XIST高表達均是影響膠質(zhì)瘤患者臨床預后的獨立因素。

綜上所述,本研究提供了有力的證據(jù)證實XIST在評估膠質(zhì)瘤患者臨床預后的潛在價值。此外,XIST可作為影響膠質(zhì)瘤患者臨床預后的獨立因素,從而為膠質(zhì)瘤的早期診斷及其治療提供新的靶點。

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