1,,3*

1.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點實驗室，云南 大理 671000；2.上海華匯拓醫(yī)藥科技有限公司，上海 浦東新區(qū) 201203；3.藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南 大理 671000

血瘀證是中醫(yī)臨床常見的證候類型之一,形成的原因主要有外傷、寒邪、郁怒、氣虛、血虛、陰陽虛等[1]。血瘀證是腦缺血的基礎(chǔ)證型，中醫(yī)常用活血化瘀療法治療腦缺血。蜜蜂蜂毒為蜜蜂科昆蟲中華蜜蜂等的工蜂尾部螫刺腺體中排出的毒汁，中醫(yī)藥及民間醫(yī)藥均有很長的使用蜂毒治療疾病的歷史，其具有祛風(fēng)濕、止痛的功效，用于治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，腰膝酸痛，坐骨神經(jīng)痛等?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，BV具有抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗輻射、抗血小板聚集等作用。臨床用于治療各種神經(jīng)炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及心血管等多種疾病。據(jù)報道[2-3]，BV至少有14個生物活性肽，如melittin、apmin、sceapin 、peptide-401等，且均具有較強(qiáng)的藥理作用和生物活性[4-8]，其具活性成分主要有活性酶類、多肽類、糖類、脂類、氨基酸類和胺類物質(zhì)等。其中，melittin可抗血小板聚集、延長小鼠體外凝血時間；apmin則可以通過血腦屏障，直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)[9]。中醫(yī)常用活血化瘀法治療腦缺血，而蜂毒體外具有很強(qiáng)的抗凝血作用[10]，本研究旨在通過建立動物血瘀模型，考察其是否具有活血化瘀的作用?；诜涠局饕煞譃槎嚯募懊割惓煞?，口服往往無效而注射給藥存在很大的致敏風(fēng)險，本試驗依據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)經(jīng)皮給藥途徑，將BV制備成涂膜劑進(jìn)行考察，以大鼠急性血瘀模型作為觀察對象，以血液流變學(xué)、凝血四項、纖溶活性等臨床常用的客觀指標(biāo)作為評定手段，系統(tǒng)地觀察BV經(jīng)皮給藥對血瘀證的影響，初步探討B(tài)V經(jīng)皮給藥的活血化瘀作用。

1 儀器與材料

1.1 藥物試劑 鹽酸腎上腺素(批號：10150902，上海禾豐制藥有限公司)；氫化可的松(批號：1501271，天津金耀藥業(yè)有限公司)；水合氯醛(批號：20120827，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；硫酸阿托品注射液(批號03141205，上海禾豐制藥有限公司)；薇婷脫毛膏(批號：J20140017，利潔時家化(中國)有限公司)；蜜蜂蜂毒(BV)(批號：20150307，大理大學(xué)藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心提供)，使用前，依據(jù)工藝制備成涂膜劑給藥。

1.2 儀器 SA-7000型全自動血液流變測試儀(北京賽科希德科技發(fā)展有限公司)；CA-620型全自動凝血分析儀(上海希森美康醫(yī)用電子有限公司)。

1.3 實驗動物 成年健康雄性(Sprague Dawley，SD)大鼠，體重250～300 g，SPF級，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK(湘)2011-0003。25℃室溫喂養(yǎng)，給予大鼠專用標(biāo)準(zhǔn)飼料、純凈水，自由取食飲水。所有實驗研究符合中國倫理委員會有關(guān)動物研究指導(dǎo)原則。

2 方法

2.1 急性血瘀模型復(fù)制 健康SD雄性大鼠60只，體重250～300 g，隨機(jī)分為6組，每組10只。即正常對照組、NS模型組、醒腦靜注射液組(1.68 mL/kg·BW)、BV高、中、低劑量組(6.40、3.20、1.60 mg/kg)。各組動物于給藥前日，用人用脫毛膏于太陽穴兩側(cè)局部脫毛。正常對照組正常飼養(yǎng)；NS模型組、醒腦靜注射液組肌肉注射給藥；BV組將涂膜劑均勻涂敷于兩側(cè)太陽穴，每側(cè)0.03 mL；涂膜劑涂抹后要待水分揮發(fā)后形成薄膜，保持10 min左右后放回籠盒；重復(fù)給藥前應(yīng)用蘸生理鹽水的棉簽輕輕擦去殘留的薄膜，每天給藥1次。預(yù)防給藥5 d，末次給藥后1 h，參考文獻(xiàn)[11-12]方法，除正常對照組外，其余各組大鼠皮下注射A 0.8 mL/kg·BW每次，共2次，間隔時間為4 h，第1次皮下注射A 2 h后，將大鼠置于4 ℃冰水中游泳5 min，2 h后第2次皮下注射A，造成急性血瘀證模型。

2.2 血液采集及指標(biāo)測定 急性血瘀各組動物于第2次皮下注射 A 24 h后取血。以10%水合氯醛0.35 mg/kg·BW腹腔注射麻醉，腹主動脈快速取血6 mL，其中4 mL用肝素抗凝，采用全自動血液流變儀分別測定全血粘度、血漿粘度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和卡松粘度。另外2 mL用3.8%枸櫞酸鈉溶液與全血1:9抗凝，采用全自動凝血分析儀測定血漿纖維蛋白原(Plasma fibrinogen，F(xiàn)IB)、纖維蛋白降解產(chǎn)物(Fibrin degradation products，F(xiàn)DP)、血漿D-二聚體(D-dimer，D-D)、活化部分凝血活酶時間(Activated partial thromboplastin time，APTT)、血漿凝血酶原時間(Plasma prothrombin time，PT)、血漿凝血酶時間(Thrombin time，TT)。

2.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計描述和統(tǒng)計分析，以均值加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)性且方差齊的，采用參數(shù)檢驗中的單因素方差分析(one-way ANOVA)比較，組間兩兩比較采用LSD(最小顯著差檢驗)，數(shù)據(jù)不符合正態(tài)性或方差不齊的采用非參數(shù)檢驗中的Kruskal-Wallis 檢驗分析比較，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 BV對急性血瘀大鼠全血粘度的影響 經(jīng)單因素方差分析，與正常對照組比較，NS模型組不同切變率全血粘度顯著升高(P<0.01)；與NS模型組比較，醒腦靜組可降低切變率為1/s、10/s和60/s的全血粘度(P<0.05)；BV中劑量組不同切變率的全血粘度均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，且切變率為1/s、10/s的全血粘度效果顯著優(yōu)于醒腦靜組(P<0.05)。見表1。

組別劑量鼠數(shù)全血粘度/mPa·s1/s10/s60/s150/s 200/s正常對照組-839.16±2.95 10.43±0.66 5.79±0.38 4.83±0.32 4.61±0.31 NS模型組-754.54±4.06??13.94±0.92??7.48±0.45??6.16±0.36??5.87±0.34??醒腦靜組1.68 mL/kg7a48.92±3.39??▲12.85±0.55??▲6.59±1.21?▲5.84±0.19??5.57±0.18??BV6.4 mg/kg748.72±5.79??▲12.61±1.26??▲6.83±0.59??5.64±0.46??▲▲5.38±0.43??▲▲3.2 mg/kg742.61±4.72▲▲▼11.65±0.97?▲▲▼6.56±0.44?▲5.50±0.35??▲▲5.27±0.33??▲▲1.6 mg/kg648.34±6.53??▲12.49±1.23??▲▲6.76±0.48?5.58±0.34??▲▲5.33±0.31??▲▲

注：與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與NS模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與醒腦靜組比較，▼P<0.05。a:實驗動物為8只，經(jīng)SPSS離散值檢驗，其中1只的各項指標(biāo)數(shù)據(jù)均為離群值，刪除了該組實驗數(shù)據(jù)，分析可能原因是所制備的血漿不合格。

3.2 BV對急性血瘀大鼠血漿粘度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)和卡松粘度的影響 經(jīng)單因素方差分析，與正常對照組比較，NS模型組大鼠血漿粘度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、卡松粘度顯著增加(P<0.01)；與NS模型組比較，BV涂膜劑中劑量組血漿粘度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、卡松粘度均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，且血漿粘度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)效果顯著優(yōu)于醒腦靜組(P<0.01或P<0.05)。見表2。

組別劑量鼠數(shù)血漿粘度/mPa·s紅細(xì)胞聚集指數(shù)卡松粘度/mPa·s正常對照組-81.32±0.02 8.50±0.573.37±0.26 NS模型組-71.61±0.09??9.28±0.24??4.18±0.23??醒腦靜組1.68 mL/kg7a1.64±0.08??8.77±0.514.04±0.14??BV6.40 mg/kg71.55±0.07??▼9.03±0.363.86±0.27??▲3.20 mg/kg71.49±0.05??▲▲▼▼8.07±0.59▲▲▼3.90±0.23??▲1.60 mg/kg61.55±0.09??▼9.04±0.763.82±0.14??▲▲

注：與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與NS模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與醒腦靜組比較，▼P<0.05，▼▼P<0.01。

3.3 BV對急性血瘀大鼠PT、APTT和TT的影響 經(jīng)Kruskal-Wallis 檢驗，與正常對照組比較，NS模型組僅TT存在統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；與NS模型組比較，所有給藥組PT、APTT及TT均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。提示BV經(jīng)皮給藥對急性血瘀大鼠凝血時間的影響并不明顯。見表3。

組別劑量鼠數(shù)PT/sAPTT/sTT/s正常對照組-816.01±0.5936.03±7.1230.50±0.67NS模型組-714.79±0.7135.43±14.9728.07±0.87?醒腦靜組1.68 mL/kg 815.19±0.9231.49±12.4328.45±1.75BV6.40 mg/kg715.01±1.24 43.01±12.83 27.89±1.54?3.20 mg/kg7 14.19±1.08?33.16±13.97 28.90±2.80 1.60 mg/kg615.10±1.53 36.77±11.76 28.26±1.25

注：與正常對照組比較，*P<0.05。

3.4 BV對急性血瘀大鼠FIB、FDP和D-二聚體的影響 經(jīng)單因素方差分析，與正常對照組比較，NS模型組大鼠血漿FIB、FDP、D-二聚體含量顯著增加(P<0.01)；與NS模型組比較，BV中劑量組可顯著降低FIB含量(P<0.01)，且效果顯著優(yōu)于醒腦靜組(P<0.01)，BV涂膜劑高、低劑量組有降低FDP和D-二聚體含量的趨勢。見表4。

組別劑量鼠數(shù)FIB/g/LFDP/μg/mLD-二聚體/μg/mL正常對照組-81.99±0.14 1.88±1.030.74±0.24 NS模型組-74.73±0.25??3.26±0.65??1.14±0.31??醒腦靜組1.68 mL/kg84.50±0.79??3.44±0.58??1.15±0.16??BV6.40 mL/kg74.41±0.43??2.70±0.671.01±0.12?3.20 mL/kg73.50±1.10??▲▲▼▼3.39±0.72??1.03±0.23?1.60 mL/kg64.64±0.47??2.75±1.440.95±0.20

注：與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，與NS模型組比較，▲▲P<0.01；與醒腦靜組比較,▼▼P<0.01。

4 討論

除傳統(tǒng)的活血化瘀中藥外，近現(xiàn)代藥理研究的許多動物藥針對心腦血管疾病均有顯著的治療作用，如水蛭[13]、蚯蚓[14]、蛛毒[15]、蛇毒[16]及昆蟲毒素[17-20]等。在部分藥用植物資源不足的情況下，這些動物資源可能是以后心腦血管疾病新藥研發(fā)的重點來源。

實驗借助“郁怒”和“寒邪”兩個病因，通過注射大劑量A模擬人暴怒時的機(jī)體狀態(tài)，施以冰水游泳，模擬“寒邪”入侵，二者共同作用來復(fù)制大鼠急性血瘀證。實驗過程中由于麻醉、低溫、游泳疲勞，部分大鼠狀態(tài)較差，有死亡。結(jié)果顯示，除了凝血系統(tǒng)相關(guān)的PT和APTT兩個指標(biāo)基本無差異外，NS模型組的血液流變學(xué)、纖溶活性等相關(guān)指標(biāo)均與正常對照組存在統(tǒng)計學(xué)差異，提示皮下注射鹽酸腎上腺素伴以4℃冰水游泳可以有效復(fù)制大鼠血急性瘀證模型。陽性藥醒腦靜注射液可降低部分血粘度，與文獻(xiàn)報道一致[21]。與模型組比較，BV可降低血瘀大鼠全血粘度、血漿粘度及卡松粘度，提示BV能有效改善急性血瘀大鼠的血流變性；與模型組比較，BV中劑量組可顯著降低FIB含量(P<0.01)，其他兩個劑量組亦有降低趨勢，提示BV能有效緩解急性血瘀模型大鼠的血液高凝狀況。結(jié)果表明，BV能顯著降低急性血瘀模型大鼠的全血粘度、血漿粘度、卡松粘度，有效改善血瘀狀況，但對內(nèi)源性(APTT)及外源性(PT)的凝血途徑均無明顯影響。其可能通過血瘀狀態(tài)下，有效抑制凝血因子FIB的生成而發(fā)揮作用。此外，BV能改善模型大鼠的血液流變性，但沒有明顯劑量依賴關(guān)系，推測原因可能與BV涂膜劑為多組分混合物及透皮吸收相關(guān)，筆者將在后續(xù)實驗中進(jìn)一步深入研究。

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