程坦 鄭杰靈 劉穎 謝國柱 袁亞維

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院放療科（廣州510515）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma）是鼻咽部起源的最常見的惡性腫瘤，好發(fā)于中國東南部、東南亞地區(qū)，并以廣東最為高發(fā)［1］。目前，放射治療（放療）或以放療為主的綜合治療是鼻咽癌的主要治療手段。雖然初診未轉(zhuǎn)移鼻咽癌患者綜合治療后5年生存率已接近85%左右，但仍有部分患者因局部復(fù)發(fā)或腫瘤轉(zhuǎn)移未能獲得長期生存［2-3］。包括鼻咽癌在內(nèi)的大多數(shù)實體瘤中廣泛存在乏氧，乏氧也被公認為是腫瘤對包括放療在內(nèi)的多種治療手段抵抗的重要原因。因此，改善腫瘤組織內(nèi)乏氧的腫瘤細胞的放射抵抗對提高鼻咽癌患者的放療療效具有重要的意義［4-5］。腫瘤細胞即使在有氧條件下，仍然主要通過糖酵解獲取能量［6］。乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）是催化腫瘤細胞胞漿中乳酸生成的糖酵解的關(guān)鍵酶之一。以往研究表明LDH-A抑制劑草氨酸鈉對體外常氧培養(yǎng)的胃癌、肺癌細胞有一定的生長抑制作用。但草氨酸鈉對乏氧鼻咽癌細胞的增殖以及放射敏感性的影響卻罕見報道。在此筆者使用草氨酸鈉干預(yù)體外乏氧培養(yǎng)的人鼻咽癌細胞CNE2，觀察其對細胞增殖、放射敏感性的影響，初步探討其潛在機制，為進一步的體內(nèi)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 顯微鏡（日本Olympus公司）；人鼻咽癌細胞CNE2為南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院放療科實驗室凍存；RPMI-1640培養(yǎng)基、0.25%胰酶（美國Gibco公司）；南美胎牛血清（美國Gibco公司）；PBS溶液（美國Hyclone公司）；100X青鏈霉素溶液（美國Gibco公司）；草氨酸鈉（上海麥克林生化科技有限公司），純度＞98%；乳酸測定試劑盒（南京建成生物科技有限公司）；人血管緊張素ⅡELISA試劑盒（美國Ray Biotech公司）；DMSO、MTT粉劑（美國Sigma公司）；酶標儀（美國Thermo公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人鼻咽癌CNE2細胞株采用含10%胎牛血清RMPI-1640培養(yǎng)液置5%CO2，37℃孵箱培養(yǎng)，待細胞進入對數(shù)生長期用PBS溶液清洗2次，然后0.25%胰酶消化，終止消化后反復(fù)吹打為單細胞懸液，計數(shù)后平鋪置96孔板、6孔板或培養(yǎng)皿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)準備后續(xù)實驗。細胞乏氧時，將貼壁后的細胞置于充滿5%CO2、95%N2混合氣體，O2濃度維持在1%的37℃孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 細胞內(nèi)乳酸含量測定 向常氧、乏氧條件下培養(yǎng)的已貼壁的CNE2鼻咽癌細胞培養(yǎng)皿中加入草氨酸鈉溶液（草氨酸鈉終濃度為20 mmol/L），對照組加入等體積的PBS。培養(yǎng)48 h后吸去培養(yǎng)基，用PBS液清洗2次，然后用0.25%胰酶消化，終止消化后1 000 r/min離心5 min得沉淀的細胞。用PBS重懸清洗細胞后再次離心，向裝有細胞的EP管中加入已預(yù)冷的生理鹽水并置于冰上勻漿。將制備好的勻漿4℃3 000 r/min離心15 min，吸取上清并按乳酸測定試劑盒說明書要求操作測定乳酸含量。

1.2.3 上清中血管緊張素Ⅱ含量測定 在24孔板內(nèi)接種2×105個/孔狀態(tài)良好的腫瘤細胞，并加入1 mL培養(yǎng)基，待細胞貼壁后，實驗組和對照組分別接受20 mmol/L和等體積PBS處理，乏氧培養(yǎng)24 h后吸取培養(yǎng)基上清至離心管內(nèi)，按照血管緊張素Ⅱ檢測試劑盒說明書步驟測定上清中血管緊張素Ⅱ含量。

1.2.4 四氮噻唑藍（MTT）實驗 接種于96孔板的細胞乏氧條件培養(yǎng)12 h后分別加入經(jīng)培基稀釋的不同濃度草氨酸鈉（終濃度分別為30、60、90 mmol/L），同時設(shè)置對照組（加入等體積的培養(yǎng)液），各組均設(shè)置6個復(fù)孔，置孵箱中繼續(xù)乏氧培養(yǎng)，藥物作用24、48、72 h后，取出相應(yīng)的96孔板每孔分別加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸棄各孔液體，每孔加入150 μL DMSO，振蕩待藍色晶體溶解后酶標儀于490 nm波長處檢測每孔的吸光度（A490）值，確定藥物對腫瘤細胞的抑制率。計算細胞生長抑制率：細胞生長抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

1.2.5 平板克隆形成實驗（colony formation assay）檢測細胞的放射敏感性［7］用0.25%胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的CNE2鼻咽癌細胞，制成單細胞懸液，以每孔200、400、2 000、4 000、和10 000個細胞接種于六孔板中，每個劑量接種3個復(fù)孔。待細胞貼壁后，草氨酸鈉組和對照組分別用20 mmol/L草氨酸鈉溶液和PBS液繼續(xù)培養(yǎng)24 h并給予0、2、4、6、8 Gy的6 MV X線滿射野照射。照射后繼續(xù)培養(yǎng)9 d，取出培養(yǎng)皿，棄去培養(yǎng)液，用1XPBS清洗2次，甲醛固定15 min。棄去固定液并用0.1%結(jié)晶紫染色并在顯微鏡下技術(shù)大于50個細胞的克隆。以0 Gy組克隆形成率為對照，計算出各個劑量組的細胞存活率?？寺⌒纬陕剩≒E）=對照組克隆數(shù)（0 Gy組克隆數(shù)）/接種細胞數(shù)×100%，存活分數(shù)（SF）=實驗組克隆數(shù)/（接種細胞數(shù)×PE）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用SPSS 18.0軟件進行，實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差表示。兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組樣本的比較采用單向方差分析，當(dāng)P＜0.05時認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 草氨酸鈉抑制CNE2細胞乳酸的生成 細胞內(nèi)乳酸水平檢測結(jié)果顯示，即使在常氧條件下，CNE2細胞內(nèi)也有較多的乳酸積累，乏氧條件下乳酸水平進一步提升。加入草氨酸鈉處理后，兩種條件下的CNE2細胞乳酸水平均顯著降低。見圖1。

圖1 草氨酸鈉處理對CNE2細胞乳酸含量的影響Fig.1 Effect of sodium oxalate on the production of lactate in CNE2 cells

2.2 草氨酸鈉抑制腫瘤細胞血管緊張素的生成常氧條件下，CNE2細胞僅產(chǎn)生少量的血管緊張素Ⅱ，乏氧條件下CNE2細胞上清血管緊張素Ⅱ含量明顯增多。20 mmol/L草氨酸鈉處理可減少兩種條件下腫瘤細胞血管緊張素Ⅱ的分泌。見圖2。

2.3 草氨酸氨對乏氧CNE2細胞增殖的抑制作用 MTT檢測結(jié)果顯示，經(jīng)30、60、90 mmol/L不同濃度草氨酸鈉處理不同時間對乏氧CNE2細胞的增殖有一定的抑制作用，且呈現(xiàn)出時間和劑量依賴性（表1），與對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.05）。

圖2 草氨酸鈉處理對CNE2細胞上清血管緊張素Ⅱ含量的影響Fig.2 Effect of sodium oxalate on the production of angiotensinⅡin CNE2 cells

表1 不同濃度草氨酸鈉與不同作用時間對乏氧CNE2細胞增殖的抑制率Tab.1 Inhibitory rate of sodium oxalate on proliferation in hypoxic CNE2 cells ± s，%

表1 不同濃度草氨酸鈉與不同作用時間對乏氧CNE2細胞增殖的抑制率Tab.1 Inhibitory rate of sodium oxalate on proliferation in hypoxic CNE2 cells ± s，%

草氨酸鈉濃度（mmol/L）30 60 90作用時間24 h 2.68±0.59 13.83±3.21 30.61±5.46 48 h 11.45±2.44 23.97±5.54 47.99±10.26 72 h 15.97±4.21 32.50±4.67 59.75±9.73

2.4 草氨酸鈉增加了乏氧腫瘤細胞的放射敏感性 克隆形成實驗結(jié)果顯示，草氨酸鈉降低了乏氧條件下培養(yǎng)的CNE2細胞經(jīng)不同劑量照射后的存活分數(shù)（survival fraction，SF）（圖3），提高了乏氧CNE2細胞的放射敏感性。

圖3 草氨酸鈉對乏氧CNE2細胞放射敏感性的影響Fig.3 Effect of sodium oxalate on the radiosensitivity of hypoxic CNE2 cells

3 討論

近年來，隨著放射生物學(xué)，尤其是放射物理學(xué)的快速發(fā)展，鼻咽癌放療臨床獲益顯著，但仍有部分患者因局部區(qū)域腫瘤的復(fù)發(fā)和發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致治療失敗。造成這一局面的重要原因是腫瘤細胞的放射生物學(xué)抵抗［8］。同其他實體瘤一樣，鼻咽癌也存在瘤內(nèi)的乏氧，與普通細胞相比乏氧的腫瘤細胞對射線有更強的抵抗力，在放療中這部分細胞不易被殺死，成為治療后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的潛在根源［9］。因此克服乏氧腫瘤細胞放射抵抗仍然是目前惡性腫瘤放射治療面臨的重要挑戰(zhàn)。

能量代謝異常是惡性腫瘤最鮮明的特征之一，雖然與氧化磷酸化相比糖酵解是一種低效的能量代謝方式，但是腫瘤細胞即使在有氧條件下仍活躍地攝取葡萄糖進行糖酵解來供應(yīng)能量。腫瘤細胞的這種能量代謝方式被稱作“有氧糖酵解”或“Warburg效應(yīng)”［6］。LDH是調(diào)節(jié)糖酵解的重要酶之一，在胞漿內(nèi)催化糖酵解途徑的產(chǎn)物丙酮酸生成乳酸完成糖酵解全過程。草氨酸鈉（sodium oxamate）是LDH-A（LDH的5種同工酶之一）的特異性抑制劑，可抑制癌細胞糖酵解的發(fā)生，阻斷癌細胞的能量供應(yīng)來源［10］。YAND等［11］在人肺腺癌H1395中發(fā)現(xiàn)草氨酸鈉可誘導(dǎo)細胞凋亡并引起G2/M期阻滯。LIU等［12］使用草氨酸鈉處理胃癌SGC-7901細胞和BGC-823細胞發(fā)現(xiàn)可抑制其增殖并降低細胞的侵襲性，誘導(dǎo)它們發(fā)生凋亡。ZHAO等［13］也在胃癌細胞中得到了相一致的結(jié)果，并發(fā)現(xiàn)草氨酸鈉可誘導(dǎo)胃癌細胞發(fā)生保護性自噬。

在此，本課題組研究了草氨酸鈉對乏氧鼻咽癌細胞CNE2體外增殖和放射敏感性的影響，及其潛在機制。結(jié)果顯示，由于“Warburg效應(yīng)”的存在，鼻咽癌細胞CNE2即使在常氧條件下仍有較多的乳酸生成，乏氧條件下乳酸的產(chǎn)生進一步增多。草氨酸鈉在兩種條件下均能夠顯著抑制乳酸的生成。相似地，在乏氧鼻咽癌細胞CNE2中，草氨酸鈉也可呈時間和劑量依賴性抑制其增殖。

腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）在腫瘤生物學(xué)中發(fā)揮著重要作用［14］，近年來的研究顯示其參與了腫瘤的化學(xué)治療、免疫治療抵抗［15-16］。血管緊張素Ⅱ（AngiotensinⅡ，AngⅡ）被認為是RAS最主要的生物活性物質(zhì)。本課題組之前的研究顯示乏氧腫瘤中AngⅡ水平明顯升高，血管緊張素Ⅱ受體1型（AngiotensinⅡreceptor type 1，AT1R）信號阻斷可提高乏氧鼻咽癌細胞的放射敏感性［17-19］。為研究草氨酸鈉對乏氧鼻咽癌細胞AngⅡ水平的影響，筆者檢測了CNE2上清中AngⅡ的含量發(fā)現(xiàn)無論常氧還是乏氧條件下草氨酸鈉均可抑制鼻咽癌細胞AngⅡ的生成。克隆形成實驗證實了草氨酸鈉可顯著提高乏氧鼻咽癌細胞CNE2的放射敏感性，因此筆者推測，其抑制AngⅡ的生成，下調(diào)AT1R信號可能是草氨酸鈉放射增敏效應(yīng)的機制之一，但仍有待進一步實驗來證實。

草氨酸鈉因其對正常組織細胞的毒性較低，作為新型放射增敏劑具有廣闊的應(yīng)用前景。筆者將繼續(xù)深入研究草氨酸鈉抑制乏氧腫瘤細胞AngⅡ生成，增強放射敏感性的分子機制并為動物水平的實驗打下基礎(chǔ)?？傊?，本研究為理解乏氧腫瘤細胞放射抵抗的機制提供了一定的理論依據(jù)，同時為克服鼻咽癌放療抵抗從而減少放療后轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)提供了新的潛在策略與手段。

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