張龍翼，陳平平，王林果，陳婷婷，張　，熊　偉，郭思亞

(成都大學(xué) 肉類加工四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都　610106)

0　引　言

魚類的皮膚與水環(huán)境直接接觸，其皮膚上覆蓋著一層由上皮細(xì)胞和表皮杯狀細(xì)胞分泌的黏液.黏液作為魚體的第一道免疫防線，具有滲透壓調(diào)節(jié)器、天然潤滑劑、化學(xué)信息傳遞介質(zhì)等多種重要的生理功能[1].研究發(fā)現(xiàn)，魚體存在局部的皮膚黏液免疫系統(tǒng)，具有一定的黏液細(xì)胞基礎(chǔ)，能獨(dú)立完成抗原攝取、呈遞及抗體分泌功能[2-4].近年來，科研人員對(duì)魚胴體黏液在魚類疾病防治以及提取并特征化其中的抗菌活性物質(zhì)等方面開展了一些研究并取得了一些成果[5-7].白烏魚是一種低脂高蛋白的經(jīng)濟(jì)魚類，營養(yǎng)價(jià)值較高.白烏魚在宰殺后，其表面有很多的黏液，但目前對(duì)其體表黏液的抗菌活性卻鮮有報(bào)道.為了更充分地發(fā)掘白烏魚的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，本研究擬對(duì)白烏魚胴體黏液的抗菌活性進(jìn)行分析.

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

1.1.1材料.

實(shí)驗(yàn)所用材料包括：新鮮白烏魚，購自成都龍泉驛區(qū)三聯(lián)汽車城水產(chǎn)市場；蛋白胨，購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；瓊脂粉、過硫酸銨(分析純)，購自成都金山化學(xué)試劑有限公司；酵母提取物，購自廣州市華粵瑞科科學(xué)器材有限公司；氯化鈉(分析純)、鹽酸(36.0%～38.0%)購自成都科龍化工試劑廠；Acrylamide(99%電泳級(jí))，購自上海麥克林生化科技有限公司；Tris、TEMED，購自北京諾其雅盛生物科技有限公司.

1.1.2儀器.

1.2　方　法

1.2.1白烏魚魚胴體黏液的收集.

新鮮白烏魚用自來水暫養(yǎng)，間隔半小時(shí)換一次水，連續(xù)3次，宰殺后刮去魚鱗，然后用手(帶乳膠手套)輕捋其體表，讓黏液流入滅菌后的器皿中，分裝后4 ℃保存?zhèn)溆?

1.2.2白烏魚魚胴體黏液抑菌活性分析.

分別取2份白烏魚體表黏液10 mL于離心管中，將其中1份黏液在沸水(96 ℃)中煮20 min.將1 mL純水、1 mL新鮮黏液、1 mL變性黏液分別均勻接種到滅菌后的LB固體培養(yǎng)基中，再放入生化培養(yǎng)箱中，在37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長狀況，每組平行3次.分別取不同培養(yǎng)基中的菌落于載玻片上，在生物顯微鏡下觀察每組單體菌落和單個(gè)菌體的生長狀態(tài)，分析其菌種的屬性.

1.2.3活性菌種放大培養(yǎng).

用滅菌牙簽挑選新鮮黏液黃色菌、新鮮黏液大菌和變性黏液大菌，分別接種到LB液體培養(yǎng)基中，將液體培養(yǎng)基放入恒溫振蕩器中，在160 r/min、30 ℃條件下振蕩24 h.

1.2.4菌落蛋白凝膠電泳分析.

用PBS緩沖液洗脫培養(yǎng)基，各取10 mL菌液，在10 000 r/min，離心5 min，倒掉上清液，再加入10 mL PBS緩沖液用旋渦混合器混勻，再離心5 min，重復(fù)3次，最后加入5 μL PBS緩沖液混勻，提取到3種放大培養(yǎng)后的蛋白.分別取80 μL放大培養(yǎng)后的蛋白，加入20 μL上樣染色液，在沸水中煮10 min，然后在旋渦混合器中混勻.各取10 μL進(jìn)樣到電泳儀中，用蛋白質(zhì)凝膠電泳觀察其蛋白質(zhì)表達(dá)情況.

1.2.5數(shù)據(jù)分析.

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel 2016對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.

2　結(jié)果與討論

2.1　魚胴體黏液變性前后的外表特征

由于白烏魚胴體黏液在采集過程容易感染雜菌，為了減少外界雜菌對(duì)后期抗菌活性的影響，在實(shí)驗(yàn)中，對(duì)黏液進(jìn)行了加熱處理，加熱處理后的魚胴體黏液見圖1.

A管為未加熱黏液；B管為加熱處理后的黏液

圖1魚胴體黏液變性前后的外表特征

由圖1可知，未加熱魚胴體黏液呈現(xiàn)淡紅色，而加熱處理后的黏液呈淡綠色.未加熱魚胴體黏液呈淡紅色，這可能是魚在去鱗后收集黏液時(shí)帶入了一些魚體血液所致；但是經(jīng)過加熱的魚胴體黏液，其顏色呈現(xiàn)淡綠色.通常血色素在加熱以后會(huì)呈褐色，而魚胴體黏液加熱后卻呈現(xiàn)淡綠色，對(duì)于導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因暫時(shí)還不明確.

2.2　魚胴體黏液的抗菌性比較

為了比較魚胴體黏液的抗菌性，取1 mL純水、1 mL新鮮黏液、1 mL加熱處理的黏液，分別均勻接種到滅菌后的LB固體培養(yǎng)基中，再放入生化培養(yǎng)箱中，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察微生物的生長狀況，結(jié)果如圖2所示.

A：取1 mL純水；B：1 mL新鮮黏液；C：1 mL加熱處理的黏液

圖2魚胴體黏液變性前后的抗菌性比較

由圖2可知，接種了新鮮黏液的培養(yǎng)基主要生長了2種菌落，即黃色菌和大菌，具體為何種微生物根據(jù)菌像難以判斷；而接種了加熱處理的黏液的培養(yǎng)基，只生長了大菌；空白組中無菌落生長.

由培養(yǎng)基上微生物生長狀況可以推測，新鮮和經(jīng)加熱處理的黏液培養(yǎng)基上所長微生物很可能不是空氣中的雜菌.因?yàn)轲ひ簾崽幚頃?huì)導(dǎo)致部分雜菌死亡，圖2(B)中不僅有黃色菌又有大菌，而圖2(C)中僅有大菌，而且圖2(B)和圖2(C)中大菌的生長直徑相當(dāng).因此，黏液中的大菌與雜菌之間很可能存在競爭性生長，而且黏液中的大菌具有較好的耐熱性，對(duì)此有必要做進(jìn)一步分析.

2.3　菌落的顯微照片

為了更加清晰地觀察培養(yǎng)基上生長菌落的菌像，對(duì)菌種進(jìn)行顯微鏡觀察，拍照結(jié)果如圖3所示.

由圖3可知，與對(duì)照(圖3(A))相比，新鮮黏液培養(yǎng)基(圖3(B))上的微生物菌像種類較加熱處理黏液(圖3(C))培養(yǎng)基上的菌像種類多.圖中橢圓圈內(nèi)的微生物不僅出現(xiàn)在新鮮黏液培養(yǎng)基上(圖3(B))，而且還出現(xiàn)在加熱處理黏液的培養(yǎng)基上(圖3(C)).由此進(jìn)一步驗(yàn)證了“2.2”項(xiàng)的推測，即大菌和黃色菌之間存在競爭性生長現(xiàn)象.

2.4　變性黏液菌落蛋白分析

為了進(jìn)一步分析大菌的特征，對(duì)黏液中的大菌進(jìn)行了放大培養(yǎng)，并提取其中的蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳分析，其電泳圖如圖4所示.

A：取1 mL純水；B：1 mL新鮮黏液；C：1 mL加熱處理的黏液

圖3黏液菌落的顯微照片

M為標(biāo)準(zhǔn)蛋白；1道為培養(yǎng)基空白；2道、3道為新鮮黏液黃色菌；4道、5道為新鮮黏液大菌；6道、7道、8道為加熱黏液大菌

圖4變性黏液菌落蛋白分析

圖4顯示，新鮮黏液黃色菌(2道、3道)中主要蛋白的分子量在100～150 kD之間，而且其中的蛋白質(zhì)種類較多；而新鮮(4道、5道)和加熱黏液(6道、7道、8道)中大菌的蛋白質(zhì)分布無明顯差異，但含量較黃色菌低.

大菌中的蛋白質(zhì)含量較低，這可能是大菌較其他雜菌耐高溫處理的可能原因.如果能進(jìn)一步對(duì)大菌中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，那么大菌中的蛋白質(zhì)很可能具有耐熱等特性，具體情況有待做進(jìn)一步研究.

3　結(jié)　論

通過比較魚胴體黏液變性前后的外表特征，發(fā)現(xiàn)未加熱魚胴體黏液呈現(xiàn)淡紅色，而加熱處理后的黏液呈淡綠色.比較魚胴體黏液的抗菌性，發(fā)現(xiàn)接種了新鮮黏液的培養(yǎng)基主要生長了2種菌落，黃色菌和大菌；而接種了加熱處理的黏液的培養(yǎng)基，只生長了大菌；空白組中無菌落生長.通過電泳分析發(fā)現(xiàn)，新鮮黏液的黃色菌中主要蛋白的分子量在100～150 kD，而且其中的蛋白質(zhì)種類較多.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大菌不僅與其他菌間存在競爭性生長特性，而且還表現(xiàn)出較高的耐熱性.