張秋雨，李　鵬，陳　晴，任鵬舉，銀　梅*，王選年*

(1.河南科技學院動物科技學院，河南新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)學院生物技術研究中心/生命科學與技術學院，河南新鄉(xiāng) 453003；3.鄭州大學生命科學學院，河南鄭州 450000)

豬瘟(Classical swine fever，CSF)俗稱“爛腸瘟”,是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)引起的一種急性、高度接觸性傳染病,臨床上以高熱稽留、精神極度沉郁及黏膜廣泛性出血等為主要特征。CSF呈世界范圍分布,不同的國家其流行程度也有差異,其發(fā)病率和病死率很高,世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為必須報告的動物傳染病,并將該病列為國際重點檢疫對象[1]。

目前,國內(nèi)外對CSF的診斷方法有傳統(tǒng)的病毒分離鑒定、免疫熒光試驗、豬體回歸感染試驗、血清學診斷及反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)等。這些方法都有各自的缺陷與不足,均不能滿足當前疾病診斷的需求及對樣品中病毒含量進行高靈敏度分析的要求[2-6]。而TaqMan qPCR是在常規(guī)PCR基礎上發(fā)展起來的一種核酸擴增技術,增加一個特定的水解探針,具有特異性強、敏感性高和重復性好等優(yōu)勢,已經(jīng)被廣泛用于動物檢疫和食品行業(yè)等病原體的檢測,可以對樣品中的病毒載量實現(xiàn)真正的動態(tài)定量[7]。CSFV屬于黃病毒科瘟病毒屬的成員,具有囊膜,病毒粒子的基因組為單股正鏈的RNA,其大小為12.3 kb,包含一個開放閱讀框(open reading frame,ORF),兩端的非編碼區(qū)(untranslated region,UTR)高度保守。E0蛋白是一種病毒吸附蛋白,是CSFV最重要的糖蛋白之一。據(jù)相關文獻報道[8],E0蛋白具有RNA酶的活性,在細胞中的表達、復制和調(diào)控機制等方面發(fā)揮重要作用。同時,國際上常常把E0基因作為是否感染CSFV的檢測依據(jù)。E0蛋白在該病的防控和致病過程中發(fā)揮極其重要的關鍵作用[9]，它可以刺激機體產(chǎn)生免疫反應,以阻斷CSFV對機體的感染。當豬感染CSFV后,其結(jié)構(gòu)糖蛋白E0可以刺激機體產(chǎn)生中和抗體,具有較強的免疫相關性,因而把E0基因的作為檢測的標記物具有重要的意義[10]。

本研究是以規(guī)模化養(yǎng)豬場遇到的一例典型的CSF病例,剖檢后進行病毒的分離鑒定。同時,以CSFV相對保守的E0基因設計1對引物和探針,建立一種特異、快速和準確的CSFVTaqMan qPCR檢測方法,并檢測CSFV在豬體內(nèi)組織中的定量分布情況。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1病毒的基因組、質(zhì)粒及試劑CSFV標準株(cDNA)、豬細小病毒(cDNA)、豬圓環(huán)病毒(DNA)、豬流行性腹瀉病毒(cDNA)、pMD19-T-E0質(zhì)粒，均由河南科技學院動物科技學院實驗室保存；2×ESTaqMasterMix、RNA提取試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2病料及實驗動物河南新鄉(xiāng)輝縣某種豬場1頭疑似感染豬瘟病毒急性發(fā)病死亡的豬尸體；新西蘭兔(2 kg左右)，購自華蘭生物疫苗有限公司實驗動物中心。

1.2　方法

1.2.1引物的設計與合成參考GenBank公布的CSFV E0基因(登錄號：KY816734.1)的相對保守核苷酸序列,根據(jù)TaqMan實時熒光定量PCR引物設計原則,利用Preimer5.0引物設計軟件分別設計2對引物和探針(表1)，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

表1　RT-PCR及TaqMan qPCR引物和探針信息

1.2.2實驗室診斷

1.2.2.1病豬剖檢 對病死豬尸體進行剖檢，并無菌取出病豬的心臟、肝臟、淋巴結(jié)、腎臟、脾臟、血液和腸道等組織器官送實驗室待檢。

1.2.2.2RT-PCR按照Trizol kit試劑盒說明書,從病變的組織樣品中提取RNA,并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,作為PCR的模板。PCR反應體系為20 μL：ddH2O 8.2 μL,上、下游引物E0 F1、E0 R1各0.3 μL,模板1.5 μL,2×ESTaqMasterMix 10 μL; PCR反應條件為：95℃ 5 min；95℃ 40 s，58 ℃ 30 s,72 ℃ 50 s,循環(huán)35次;最后進行72 ℃ 10 min。PCR擴增產(chǎn)物進行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果,膠回收產(chǎn)物送上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

1.2.2.3免疫交互試驗將豬尸體的淋巴結(jié)和脾臟充分剪碎研磨后，用無菌的生理鹽水按1∶5稀釋，5 000 r/min離心10 min后取上清,取2只健康且體重接近的家兔,按4 mL/只進行肌肉注射,另外取2只家兔注射生理鹽水作為對照組。1周后對上述4只家兔耳緣靜脈注射1∶10的豬瘟兔化弱毒(0.5 mL/只),24 h后,每間隔6 h測定1次體溫,共測16次。在攻毒后,對照組2/3以上不出現(xiàn)定型熱或輕型熱，則表明免疫交互試驗成立，結(jié)果判定標準見表2。

1.2.3TaqMan熒光定量PCR標準曲線的建立將重組質(zhì)粒pMD19-T-E0，梯度稀釋為1010～103拷貝/μL作為標準品(模板)，進行TaqMan qPCR。通過前期的預試驗對TaqMan熒光定量PCR的反應條件和參數(shù)進行了優(yōu)化,確定其最優(yōu)的反應體系為10 μL：2×PCR Master Mix 5 μL，上、下游引物E0 F2和E0 R2各0.2 μL,探針0.2 μL,模板1 μL,ddH2O 3.4 μL;最佳反應程序為：95℃ 5 min；94℃ 15 s,58℃ 30 s,72℃ 10 s,同時捕捉FAM信號,進行40個循環(huán),軟件自動生成動力學曲線和熔解曲線,并建立標準曲線。

表2　診斷CSF的兔體交互試驗判定標準

注：+：有發(fā)熱；-：無發(fā)熱。

Note：+：Fever；-：No fever.

1.2.4TaqMan實時熒光定量PCR的特異性和重復性分析以CSFV石門株、豬細小病毒(PPV)、豬圓環(huán)病毒(PCV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)等病毒的DNA或cDNA為模板,同時用水作為空白對照,進行TaqMan實時熒光定量PCR檢測,并根據(jù)熒光信號的變化判斷其特異性。按照上述建立的TaqMan實時熒光定量PCR的反應條件和體系,以107拷貝/μL～105拷貝/μL重組質(zhì)粒為模板,分別進行批內(nèi)和批間重復性試驗,對稀釋的每一個拷貝數(shù)進行3個平行重復試驗,驗證其穩(wěn)定性。并根據(jù)實時熒光定量PCR擴增的標準“S”形曲線而變化的熒光信號強度,求出Ct值,然后把Ct值帶入標準曲線計算出該樣品檢測的起始濃度。用統(tǒng)計學軟件計算其變異系數(shù)(CV)。

1.2.5TaqMan實時熒光定量PCR檢測CSFV在組織中的分布病死豬剖檢后,采集各部位的病料,包括心臟、肝臟、淋巴結(jié)、腎臟、脾臟、血液及腸道等器官和組織。按照RNA提取試劑盒的操作說明提取各樣品的RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,用TaqMan實時熒光定量PCR檢測各樣品中病毒含量的分布。每個樣品進行3個平行試驗,同時設置標準曲線。

2　結(jié)果

2.1　病理變化

剖檢的主要病理變化為眼結(jié)膜潮紅,腹部、臀部、耳部、頸部和四肢內(nèi)側(cè)等皮膚出現(xiàn)暗紫色斑且全身彌漫性出血和壞死(圖1A)；皮下組織有彌漫性出血點,血液凝固不良(圖1B)；脾臟邊緣有多個較硬的出血梗死,呈黑色,大小不一；心肌外膜出血；肺臟有散在的出血病變和輕微的梗死(圖1C)；可見腎臟表面蒼白有針尖狀的出血點或大的出血斑(圖1D)，出血部位以皮質(zhì)表面多見,呈現(xiàn)典型的“雀斑腎”外觀,其皮質(zhì)和髓質(zhì)區(qū)域有嚴重的多量點狀出血,水腫,呈紅黃色,腎盂黏膜有嚴重的彌漫性出血(圖1E,圖1F)；腸道漿膜和回盲口處有小的點狀出血斑,大腸黏膜上形成近似圓形的紐扣狀潰瘍灶(圖1G)；胃黏膜有出血(圖1H)；肋骨和肋骨膜有嚴重的出血斑點病變，肋骨近端到肋軟骨交界部位有明顯的骨化線(圖1I)。

2.2　RT-PCR擴增

以CSFV的cDNA為模板對E0基因進行擴增,其產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳顯示其條帶大小為626 bp(圖2),陰性對照擴增后無條帶。測序結(jié)果與GenBank中公布的E0基因的標準序列(GenBank登錄號：KY816734.1)經(jīng)BLAST比對,核苷酸序列的同源性為100%。

圖1　疑似CSF病豬剖檢后的大體病變

M.DNA標準DL 1 000；1.陰性對照；2～8.檢測樣品分別為心臟、肝臟、血液、腎臟、脾臟、淋巴結(jié)和腸道組織

M.DNA Marker DL 1 000；1.Negative control；2-8.Samples form heart,liver,blood,kidney,spleen,lymph nodes and intestinal tissues

圖2CSFV的RT-PCR檢測結(jié)果

Fig.2RT-PCR detection results of CSFV

2.3　兔體交互試驗

注射疫苗和病料后每隔6 h測量體溫1次,連續(xù)測96 h(表3)。試驗組的A號、B號家兔體溫變化范圍分別為39.5℃～41.9℃、39.6℃～41.3℃,溫差1.7℃～2.4℃,說明試驗組注射病料和免疫豬瘟兔化弱毒疫苗后均出現(xiàn)明顯熱型反應,則表明被檢病料中含有CSFV強毒。而對照組的C號、D號家兔注射生理鹽水后沒有出現(xiàn)熱型反應,表明整個試驗成立。

表3　各組試驗兔體溫變化情況

2.4　TaqMan實時熒光定量PCR標準曲線的建立

以1010拷貝/μL～103拷貝/μL的標準質(zhì)粒作為TaqMan qPCR的模板,擴增反應結(jié)束后,其擴增曲線見圖3A,得到的熔解曲線較好,只出現(xiàn)整齊單一的特異性峰,沒有引物二聚體現(xiàn)象(圖3B),軟件自動生成標準曲線見圖3C,其擴增效率為99.76%,標準品的濃度與Ct值呈現(xiàn)良好的線性關系,相關系數(shù)(R2)值為0.998 9,標準曲線的回歸方程為y=-3.295x+8.96。

2.5　TaqMan實時熒光定量PCR的特異性

以CSFV標準株(cDNA)、豬細小病毒(cDNA)、豬圓環(huán)病毒(DNA)和豬流行性腹瀉病毒(cDNA)等樣品作為模板,采用本實驗室已經(jīng)建立的CSFV E0基因的TaqMan實時熒光定量PCR進行擴增。結(jié)果表明，只有CSFV標準株出現(xiàn)單一、特異性的“S”形曲線(圖4),而其他陰性對照沒有檢測出陽性峰值信號。

2.6　TaqMan熒光定量PCR方法的重復性

以3個不同的濃度梯度的重組質(zhì)粒作為模板，用TaqMan qPCR進行檢測，其組間和組內(nèi)的重復性試驗結(jié)果的Ct值和變異系數(shù)見表4,該方法的批內(nèi)變異系數(shù)為0.14%～1.62%,批間變異系數(shù)為0.64%～1.52%,其變異系數(shù)均小于2%，表明該方法不但具有良好的重現(xiàn)性,而且穩(wěn)定性也比較好,其中陰性對照(N)沒有檢測到熒光信號，無擴增曲線產(chǎn)生。

2.7　檢測臨床樣品中CSFV在組織中的分布情況

以本實驗室診斷由于急性感染CSFV死亡的豬,剖檢后取體內(nèi)各組織臟器,并分別提取RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板,進行TaqMan qPCR檢測,從圖5中可知E0基因的的擴增曲線良好,熔解曲線整齊單一，且沒有其他雜峰出現(xiàn)。淋巴結(jié)中CSFV含量最高,其次為脾臟、腎臟、腸道組織、血液和心臟,肝臟中CSFV含量最低,對照組未檢測出病毒RNA。

3　討論

豬瘟是一種具有高度傳染性的疾病,其傳播快、流行廣,多為混合感染,給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。目前對于豬瘟的診斷方法有病毒分離鑒定、原位雜交、免疫組化、RT-PCR和RT-nPCR[7,11]等。但傳統(tǒng)的檢測方法十分繁瑣,耗時長、成本較高,不適合大樣本量的檢測。而分子生物學方法中的RT-PCR容易引起交叉污染,且不能準確定量，實時熒光定量RT-PCR操作簡單、靈敏度高、重復性好，可以對組織中的病毒進行定量分析等優(yōu)勢被廣泛應用,但對于CSFV的早期感染的鑒別診斷還存在著許多缺陷。而TaqMan qPCR是在RT-PCR的基礎上增加了一個TaqMan探針,該方法具有很高的特異性、敏感性和重復性，尤其是對于CSFV的早期臨床診斷提供了一個較為可靠的工具。

A.標準質(zhì)粒；B.熔解曲線；1～8.質(zhì)粒濃度分別為1010拷貝/μL～103拷貝/μL；C.標準曲線

A.Standard plasmid；B.Dissolution curve;1-8.Plasmid concentrations were 1010-103copies/μL;C.Standard curve

圖3以質(zhì)粒為模板的TaqMan熒光定量PCR標準曲線

Fig.3Standard curves ofTaqMan fluorescent quantitative PCR with plasmid as template

1.CSFV cDNA;2.豬細小病毒cDNA;3、4.分別為豬圓環(huán)病毒DNA和豬流行性腹瀉病毒cDNA；5.陰性對照

1.CSFVcDNA;2.Porcine parvovirus cDNA;3，4.Porcine circovirus cDNA and porcine epidemic diarrhea virus cDNA,respectively；5.Negative control

圖4　TaqMan熒光定量PCR特異性檢驗動力學曲線

圖5　TaqMan熒光定量PCR檢測CSFV在組織中的分布

本試驗通過對臨床遇到的一例典型疑似豬瘟病死豬,通過大體病變、RT-PCR及兔體交互試驗進行診斷,確定該病死豬由于感染CSFV而引起的急性死亡。但目前還沒有完全了解CSFV感染機體后的病毒復制、增殖、分布、組織嗜性和傳播特性等一系列問題。因此,為了更進一步了解CSFV侵入機體后在組織中分布和病豬死亡的相關性，本試驗根據(jù)CSFV E0基因的相對保守核苷酸序列設計1對特異性引物和探針,建立了檢測CSFV 的TaqMan qPCR方法,該方法只對CSFV cDNA有陽性擴增曲線,且重復性較好。而對豬細小病毒(PPV)、豬圓環(huán)病毒(PCV)和豬流行性腹瀉病毒(PEDV)均沒有陽性擴增信號，表明該方法的特異性強。本試驗對遇到的典型臨床死亡的豬瘟病例進行剖檢后,對體內(nèi)各組織器官中的病毒含量進行檢測,結(jié)果顯示，CSFV感染豬后其主要侵襲部位為淋巴結(jié)、心臟、血液、脾臟、腎臟和腸道等組織。在本次研究中也發(fā)現(xiàn)，血清中病毒含量也相對比較高,這可能是當豬感染CSFV急性死亡后,通過糞便和尿液向外界排毒,從而引起病毒可以通過全身傳播進而對外界環(huán)境造成污染和傳播疫病[12]。同時,這些檢測結(jié)果也提示,CSFV存在于該死亡豬的全身各個組織器官及血液當中,可能是造成豬急性死亡的主要原因。

CSFV在淋巴組織和血液中的病毒載量幾乎是最高的,同時,心臟、十二指腸、腦、胃和骨骼肌的病毒含量相對較低。一般認為,當豬感染CSFV后扁桃體是病毒載量最豐富的組織,而這次檢測發(fā)現(xiàn)只有中等的病毒含量,這可能與動物的年齡、病毒毒力和劑量以及動物分娩前后等因素有關[13-15]。這與DiasN L等[16]應用TaqMan熒光定量PCR對145份病料的檢測結(jié)果差別較大,這可能與病毒的地區(qū)性毒株有一定的關系。Woniakowski G等[17]用SYBR Green熒光定量PCR分析了CSFV感染豬后其血液和組織樣品中的病毒含量；朱長康[18]通過人工感染CSFV,用病理組織學方法,檢測各個臟器中CSFV載量，從而進一步研究CSFV在體內(nèi)臟器的的動態(tài)分布、臨床癥狀和組織嗜性的相關性。本試驗的樣品來自臨床上由于感染豬瘟病毒后急性死亡的典型病豬作為研究對象,并利用建立的TaqMan qPCR檢測了急性死亡病例中CSFV在不同器官和血液中的分布情況,為進一步開展CSFV的定量檢測、綜合防控和感染機制的研究奠定了基礎。