周吉東,郝曉蔚,王 敏,史吉平,郝 健*

1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院,工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室,天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津 300457

2.中國科學(xué)院上海高等研究院,上海 201210

3.河北科技大學(xué),河北 石家莊 050018

克雷伯肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)是一種重要的工業(yè)微生物，可用于生產(chǎn)1,3-丙二醇[1]、2,3-丁二醇[2]、2-酮基葡萄糖酸[3]、乙偶姻等[4]。2,3-丁二醇作為一種平臺化合物，被廣泛應(yīng)用于塑料、溶劑、合成橡膠等領(lǐng)域，并且是一種重要的潛在生物能源[5]。自然界中有許多微生物可以合成2,3-丁二醇，其中生產(chǎn)效率較高的有克雷伯肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌(Klebsi ella oxytoca)[6]、粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)[7]和多粘芽孢桿菌(Bacillus polymyxa)[8]。

2,3-丁二醇生物合成途徑從丙酮酸開始，兩分子丙酮酸在α-乙酰乳酸合成酶的催化下形成乙酰乳酸，乙酰乳酸在脫羧酶催化下形成乙偶姻，乙偶姻進一步還原形成2,3-丁二醇。在克雷伯肺炎桿菌中2,3-丁二醇代謝途徑相關(guān)基因形成bud操縱子[9]。budB編碼α-乙酰乳酸合成酶，budA編碼乙酰乳酸脫羧酶，budC編碼丁二醇脫氫酶。乙酰乳酸除了用于合成2,3-丁二醇外，還是合成纈氨酸的前體，在纈氨酸合成途徑中同時存在ilvB和ilvI兩個乙酰乳酸合成酶編碼基因。但是目前這三個乙酰乳酸合成酶基因在克雷伯氏肺炎桿菌合成2,3-丁二醇過程中的貢獻并不清楚。

課題組先期關(guān)于2,3-丁二醇異構(gòu)體合成機理的研究中發(fā)現(xiàn)：budC編碼的丁二醇合成酶是菌株中主要催化乙偶姻到2,3-丁二醇的酶，budC突變株2,3-丁二醇的產(chǎn)量明顯降低，并大量積累乙偶姻，但是菌體仍然合成少量2,3-丁二醇。這是因為除了budC編碼的丁二醇脫氫酶外，dhaD編碼的甘油脫氫酶也具有丁二醇脫氫酶活性，并且特異性的將乙偶姻的酮基轉(zhuǎn)化成R構(gòu)型的羥基[10]。另外gldA編碼的甘油脫氫酶和acyI編碼的短鏈酰基脫氫酶也被報道具有丁二醇脫氫酶活性[11,12]。但是這些基因編碼的酶在菌株合成2,3-丁二醇中的貢獻程度，以及除了這三個丁二醇脫氫酶外，菌株中是否還有其他丁二醇脫氫酶，并不清楚。

針對以上問題，本文構(gòu)建了budB、ilvB、ilvI單突變株，和kp-ΔbudC-ΔdhaD-ΔgldA-Δacyl四基因突變株。通過考察突變株合成2,3-丁二醇的變化情況，確定budB、ilvB、ilvI編碼的三個乙酰乳酸合成酶在乙酰乳酸合成中的貢獻，同時確定dhaD，gldA和acyl對菌株合成2,3-丁二醇的貢獻。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒及引物 本實驗所用到的菌株及質(zhì)粒見表1，所用引物見表2。

表1 實驗用菌株及質(zhì)粒Table 1 Experiment strains and plasmids

1.1.2 培養(yǎng)基及制備方法 種子培養(yǎng)基(g/L)：氯化鈉10，胰蛋白粉10，酵母粉5。種子培養(yǎng)基制備方法：稱量好相應(yīng)種子培養(yǎng)基試劑后用水定容至1 L，攪拌混勻后分別分裝50 mL種子培養(yǎng)基于250 mL三角搖瓶內(nèi)滅菌待用。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖100，玉米漿4，(NH4)2SO45，KCL 0.4，NaAc 3，MgSO40.1，F(xiàn)eSO40.02，MnSO40.01，酵母粉 5。

表2 PCR實驗所需引物Table 2 Primer for PCR experiment

1.2 方法

1.2.1 重組菌株的構(gòu)建 克雷伯肺炎桿菌基因突變株構(gòu)建利用Red重組酶輔助的同源重組系統(tǒng)，具體操作原料和方法過程見Wei D.et al.[14]。

以敲除gldA基因為例：首先是要構(gòu)建帶有目的基因長同源臂的同源重組質(zhì)粒，以gldA-s1和gldA-a1為引物擴增克雷伯肺炎桿菌基因組，得到gldA片段，與PMD18T-vector(simple)連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，涂于氨芐霉素抗性平板，待長出菌落，利用菌落PCR篩選陽性克隆，得到菌株DH5α-T-gldA。提取質(zhì)粒pMD18T-gldA，化轉(zhuǎn)入帶有表達Red重組酶質(zhì)粒pIJ790的大腸桿菌感受態(tài)DH5α-PIJ790中，涂布于氯霉素和氨芐霉素雙抗平板，待長出菌落，利用菌落PCR篩選陽性克隆，篩選獲得的重組大腸桿菌DH5α-PIJ790-T-gldA。以質(zhì)粒PIJ778為模板，利用引物gldA-FRT-s1和gldA-FRT-a1擴增獲得鏈霉素抗性盒，該DNA兩側(cè)連接有39 bp的gldA同源臂。利用該抗性盒轉(zhuǎn)化DH5α-PIJ790-T-gldA感受態(tài)細(xì)胞。涂布于鏈霉素抗性平板，菌落PCR驗證篩選陽性單菌落，得到菌株 DH5α-T-ΔgldA。菌株中pMD18T-gldA質(zhì)粒的 gldA基因已經(jīng)被重組失活，重命名為pMD18T-ΔgldA。提取質(zhì)粒pMD18T-ΔgldA為模板，以引物gldA-s1和gldA-s1擴增得到含有長gld同源臂的抗性盒。將該片段電轉(zhuǎn)化入帶有pDK6-red質(zhì)粒的克雷伯肺炎桿菌感受態(tài)細(xì)胞，利用鏈霉素抗性平板篩選。待長出菌落利用菌落PCR驗證，即為gldA基因缺失克雷伯氏肺炎桿菌突變株。基因acyl、budB、ilvB、ilvI的突變株構(gòu)建方法同上。

1.2.2 重組菌株抗性的消除 在突變株構(gòu)建成功后需要將其抗性進行消除，以方便構(gòu)建多基因敲除的突變株。首先需要消除pDK6-red質(zhì)粒，在無抗LB試管培養(yǎng)基中，加入10 μL/1 mL LB的10%(w/v)SDS，之后接種含pDK6-red質(zhì)粒的突變菌株，每隔12 h傳代1次，3～4次傳代后，將菌液稀釋107涂布于無抗LB平板，利用無抗LB平板和卡那霉素抗性平板進行印章法篩選，當(dāng)無抗板上可以生長而卡那霉素抗性平板上不能生長的，即為pDK6-red質(zhì)粒已消除的重組菌株。接著將pDK6-flp質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入已消除pDK6-red質(zhì)粒的重組菌中，每隔12 h傳代的同時加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)，將多次傳代后的菌液稀釋107后涂布于無抗LB平板培養(yǎng)，利用無抗LB平板和抗性平板進行印章法篩選，當(dāng)無抗板上可以生長而抗性平板上不能生長的，即為抗性基因已消除的重組菌株。最后同樣方法消除pDK6-flp質(zhì)粒，菌株可以進行下一輪基因重組。

1.2.3 發(fā)酵條件 種子菌株培養(yǎng)于裝有50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL三角搖瓶內(nèi)，于搖床培養(yǎng)箱中37℃，200 r/min培養(yǎng)9～10 h。將50 mL已培養(yǎng)好的種子液接種于5 L發(fā)酵罐中(BIOSTAT-A plus Sartorius)，發(fā)酵罐裝液量為3 L。發(fā)酵溫度37℃，采用流加NaOH的方式自動控制pH穩(wěn)定在6.0，通風(fēng)量2 L/min，轉(zhuǎn)速300 r/min。發(fā)酵結(jié)果均為3次平行實驗數(shù)據(jù)的平均值。

1.2.4 分析方法 使用紫外分光光度計(DU730 Beckman)檢測OD600 nm下菌體濃度數(shù)值，發(fā)酵液中葡萄糖、琥珀酸、乳酸、乙酸、乙偶姻、meso-2,3-丁二醇、2R,3R-丁二醇、乙醇等產(chǎn)物利用高效液相色譜檢測。采用島津20AVP色譜儀，裝備RID-10A示差檢測器，采用有機酸分析色譜柱Aminex HPX-87H(Bio-Rad)色譜柱，柱溫65℃，流動相為0.005 mol/L的H2SO4，流速為0.8 mL/min。取1 mL發(fā)酵液于1.5 mL離心管中，以12000 r/min在離心機中離心10 min，取上清液用超純水稀釋20倍，經(jīng)水相膜過濾后進樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 α-乙酰乳酸合成酶功能基因研究

budB、ilvB以及ilvI這三個基因都編碼α-乙酰乳酸合成酶，分別構(gòu)建三個基因單獨突變株，篩選到的突變株菌落PCR驗證結(jié)果如圖1，2所示。

圖1 budB和ilvB突變株單菌落PCR結(jié)果Fig.1 PCR result of bud and ilvB mutant single colony

圖2 ilvI突變株單菌落PCR結(jié)果Fig.2 PCR result of ilvI mutant single colony

將構(gòu)建成功的kp-ΔbudB，kp-ΔilvB，kp-ΔilvI三株突變株以野生型克雷伯氏肺炎桿菌K.pneumoniaeCGMCC 1.6366(kp)為對照進行批次發(fā)酵實驗，并檢測發(fā)酵過程中主要代謝產(chǎn)物和菌體濃度，發(fā)酵結(jié)果如圖3所示。

圖3 kp和 kp-ΔbudB，kp-ΔilvB，kp-ΔilvI發(fā)酵生產(chǎn) 2,3-丁二醇過程Fig.3 2,3-butanediol production by kp,kp-ΔbudB,kp-ΔilvB and kp-ΔilvI

圖3 A顯示，kp-ΔilvB和kp-ΔilvI兩株突變株與對照菌株的菌體生長情況形似，在前10 h內(nèi)菌體生長迅速，而kp-ΔbudB菌體濃度不高，只有上述菌株菌體濃度的一半左右。在15 h左右菌體濃度達到最高值，圖3 B中，kp-ΔilvB與kp-ΔilvI兩株突變株和對照菌株kp葡萄糖消耗速率相似，都在19 h左右耗盡底物，而kp-ΔbudB突變株葡萄糖消耗速率十分緩慢，在19 h時還有37.8 g/L葡萄糖。在圖3 C，D，E中，kp-ΔilvB與kp-ΔilvI兩株突變株與對照菌株在meso-2,3-丁二醇，2R,3R-丁二醇和乙偶姻的產(chǎn)量以及生產(chǎn)速率上都相似，kp-ΔilvB和kp-ΔilvI與對照菌株的meso-2,3-丁二醇產(chǎn)量分別為27.5 g/L，26.9 g/L，27.1 g/L；2R,3R-丁二醇產(chǎn)量分別為2.7 g/L，2 g/L，2.6 g/L；乙偶姻產(chǎn)量分別為0.38 g/L，0.36 g/L，0.36 g/L，但在kp-ΔbudB突變株中，這三種產(chǎn)物都沒有積累。在圖3 F，H中kp-ΔilvB和kp-ΔilvI兩株突變株表現(xiàn)出了十分相似的產(chǎn)物生產(chǎn)速率與產(chǎn)量，琥珀酸，乙醇的產(chǎn)量分別為2.5 g/L，2.7 g/L；5.5 g/L，5.7 g/L，略高于對照菌株kp的2.3 g/L，3.9 g/L。kp-ΔbudB突變株中這兩種產(chǎn)物積累較少，分別為1.2 g/L和1.3 g/L。而在圖3 G中，kp-ΔbudB突變株乳酸的產(chǎn)量相較其它菌株十分高，達到了26.3 g/L，kp-ΔilvB與kp-ΔilvI兩株突變株和對照菌株kp的乳酸的生產(chǎn)速率相似，產(chǎn)量較低。

從發(fā)酵結(jié)果可以看出kp-ΔbudB突變株2,3-丁二醇合成完全消失，而kp-ΔilvB與kp-ΔilvI兩個突變株對于2,3-丁二醇積累合成并無明顯影響。表明budB編碼的乙酰乳酸合成酶是菌體中唯一有功能催化乙酰乳酸合成的酶。

2.2 丁二醇脫氫酶功能基因研究

已報道的能夠催化乙偶姻轉(zhuǎn)化成2,3-丁二醇的酶包括：丁二醇脫氫酶（budC編碼）、甘油脫氫酶（dhaD編碼）、甘油脫氫酶（gldA編碼），和短鏈?；摎涿福╝cyI編碼），其中budC編碼的丁二醇脫氫酶對2,3-丁二醇貢獻最大，但是其他酶對菌株合成2,3-丁二醇的貢獻并不清楚。在kp-ΔbudC的基礎(chǔ)上，本文構(gòu)建了kp-ΔbudC-ΔdhaD-ΔgldA-Δacyl四基因缺失突變株，篩選到的突變株菌落PCR驗證結(jié)果如圖4所示。

圖4 kp-ΔbudC-ΔdhaD-ΔgldA-Δacyl單菌落 PCR 結(jié)果Fig.4 PCR results of single colony kp-ΔbudC-ΔdhaD-ΔgldA-Δacyl

將構(gòu)建成功的kp-ΔbudC-ΔdhaD-ΔgldA-Δacyl四敲菌株以kp-ΔbudC為對照進行批次發(fā)酵實驗，并檢測發(fā)酵過程中主要代謝產(chǎn)物和菌體濃度，發(fā)酵結(jié)果如圖5所示。

圖5 kp-ΔbudC 和 kp-ΔbudC-ΔdhaD-ΔgldA-Δacyl發(fā)酵生產(chǎn)乙偶姻過程Fig.5 Acetoin fermentation process by kp-ΔbudC and kp-ΔbudC-ΔdhaD-ΔgldA-Δacyl

根據(jù)圖5 A結(jié)果顯示，kp-ΔbudC與kp-ΔbudC-ΔdhaD-ΔgldA-Δacyl兩株突變株菌體生長情況類似，在 4～8 h內(nèi)兩突變株菌體生長迅速，但kp-ΔbudC-ΔdhaD-ΔgldA-Δacyl生長速率快于kp-ΔbudC，并且在發(fā)酵結(jié)束時kp-ΔbudC-ΔdhaD-ΔgldA-Δacyl的菌體濃度高于kp-ΔbudC。從圖5 B 可以看出，kp-ΔbudC-ΔdhaD-ΔgldA-Δacyl的 發(fā) 酵 周 期 快 于kp-ΔbudC， 在 耗 盡 葡 萄 糖 底 物 時 ，kp-ΔbudC-ΔdhaD-ΔgldA-Δacyl用了 13.5 h，kp-ΔbudC則用了 14.5 h。從圖5 C，D 中可以看出 meso-2,3-丁二醇和2R,3R-丁二醇分別在8 h和6 h后開始合成積累，發(fā)酵終止時，對照kp-ΔbudC的meso-2,3-丁二醇與2R,3R-丁二醇產(chǎn)量分別為1.35 g/L和1.39 g/L，略高于kp-ΔbudC-ΔdhaD-ΔgldA-Δacyl的1.1 g/L和1.05 g/L。圖5 E中可以看出對照kp-ΔbudC和kp-ΔbudC-ΔdhaD-ΔgldA-Δacyl的乙偶姻生產(chǎn)速率和產(chǎn)量相似，發(fā)酵結(jié)束時kp-ΔbudC-ΔdhaD-ΔgldA-Δacyl乙偶姻產(chǎn)量為31.5 g/L，對照kp-ΔbudC乙偶姻產(chǎn)量為30.5 g/L。在圖5 F，H中兩株菌的琥珀酸、乙醇生產(chǎn)趨勢相同，而對照kp-ΔbudC的琥珀酸，乙醇產(chǎn)量為2.3 g/L，4.1 g/L都高于kp-ΔbudC-ΔdhaD-ΔgldA-Δacyl的1.8 g/L，3.5 g/L。而在圖3 G中，kp-ΔbudC-ΔdhaD-ΔgldA-Δacyl突變株在發(fā)酵終點時乳酸的產(chǎn)量高于對照kp-ΔbudC。

從結(jié)果可以看出在kp-ΔbudC基礎(chǔ)上敲除了甘油脫氫酶基因dhaD、gldA以及短鏈?；摎涿竌cyl后，雖然兩種構(gòu)型的2,3-丁二醇產(chǎn)量相較于kp-ΔbudC對照略微有所下降，但還是會有2,3-丁二醇的生成。表明dhaD、gldA和acyl編碼的酶蛋白對于菌株合成2,3-丁二醇的貢獻微弱。

3 討論

2,3-丁二醇合成途徑是K.pneumoniae中非常重要的一條代謝途徑，菌株利用糖類為碳源時，2,3-丁二醇是菌株主要的代謝產(chǎn)物。K.pneumoniae中2,3-丁二醇合成途徑最早由Stormer于1975年提出[16]，代謝途徑中酶蛋白的編碼基因由Blomqvist等于1993年在土生克雷伯氏菌（Klebsiella terrigena）中進行了鑒定[9]。乙酰乳酸不單單是乙偶姻的前體物，還是合成纈氨酸的前體物。纈氨酸合成途徑中的乙酰乳酸合成酶是否對丁二醇合成有貢獻，并無研究報道。本文研究結(jié)果表明，在2,3-丁二醇發(fā)酵條件下，纈氨酸合成途徑的乙酰乳酸合成酶對2,3-丁二醇合成無貢獻。ilvB和ilvI是纈氨酸合成途徑上乙酰乳酸合成酶基因，而本文中用于2,3-丁二醇生產(chǎn)的培養(yǎng)基是一種完全培養(yǎng)基，在此條件下，細(xì)胞表達纈氨酸合成的相關(guān)基因可能并不表達，或表達微弱。

在2,3-丁二醇合成途徑中budC編碼的丁二醇脫氫酶催化乙偶姻與2,3-丁二醇之間的反應(yīng)。Ui等人對于乙偶姻轉(zhuǎn)化成2,3-丁二醇的過程有很多研究，他們提出細(xì)胞中有三種丁二醇脫氫酶，催化不同2,3-丁二醇的合成[17]。我們對這一反應(yīng)進行研究后，得到dhaD編碼的甘油脫氫酶催化R-乙偶姻合成2R,3R丁二醇的結(jié)論[10]。同時又有人提出了gldA編碼的甘油脫氫酶和arcyI編碼的的短鏈?；摎涿敢泊呋遗家龅?,3-丁二醇的反應(yīng)[11,12]。本文研究表明，在利用葡萄糖為碳源情況下dhaD、gldA和acyl對于菌株合成2,3-丁二醇的貢獻微弱。同時菌株中還存在其他具有丁二醇脫氫酶活性的酶蛋白。根據(jù)目前的研究報道，細(xì)胞合成的2,3-丁二醇僅通過乙偶姻還原生成。四突變株中依然存在能催化乙偶姻轉(zhuǎn)化成2,3-丁二醇的酶類，這是由于細(xì)胞中存在多種醇脫氫酶，而醇脫氫酶的底物轉(zhuǎn)移性并不很嚴(yán)格，包括dhaD和gldA編碼的甘油脫氫酶和arcyI編碼的的短鏈?；摎涿傅榷喾N醇類脫氫酶都具有2,3-丁二醇脫氫酶活性。雖然在細(xì)胞合成2,3-丁二醇過程中，這些醇脫氫酶的活性比budC編碼的2,3-丁二醇脫氫酶活性低，但是這些脫氫酶的存在使得budC突變株依然能夠合成少量2,3-丁二醇。acyl的表達調(diào)控目前未見報道。dhaD和gldA都是甘油脫氫酶，這兩個基因的表達受到甘油誘導(dǎo)，dhaD負(fù)責(zé)厭氧下甘油代謝，gldA負(fù)責(zé)好氧條件下甘油代謝[18]。在以甘油為碳源時，菌株2R.3R-丁二醇合成量提高，既是dhaD表達量升高的結(jié)果[10]。而在以葡萄糖為碳源時，dhaD和gldA表達水平受限，所以對2,3-丁二醇合成貢獻很小。

4 結(jié)論

本研究利用Red重組系統(tǒng)在K.pneumoniae中對2,3-丁二醇合成途徑中催化乙酰乳酸合成和2,3-丁二醇合成的相關(guān)基因進行了突變。通過突變株生理特性變化對以葡萄糖等為碳源時細(xì)胞中2,3-丁二醇合成途徑的功能基因進行了研究。結(jié)果表明，在生產(chǎn)2,3-丁二醇時，budB編碼的乙酰乳酸合成酶是細(xì)胞中唯一的功能性乙酰乳酸合成酶；催化乙偶姻轉(zhuǎn)化成2,3-丁二醇反應(yīng)的主要功能酶酶為budC編碼的丁二醇脫氫酶，其他醇脫氫酶對于該反應(yīng)的貢獻微弱。本研究結(jié)果對于利用克雷伯氏肺炎桿菌生產(chǎn)2,3-丁二醇的代謝工程改造具有指導(dǎo)作用。

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