王 磊，趙 芳，陳振華，楊俊東，蘇建平，張同作，林恭華1,

(1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，中國科學(xué)院高原生物適應(yīng)與進(jìn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810001；2.青海省動(dòng)物生態(tài)基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810001； 3.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049； 4.青海中科蜜蜂研究院，青海 西寧 810001)

Lin Gong-huaE-mail:lingonghua@nwipb.cas.cn

熊蜂(Bombusspp.)是膜翅目(Hymenoptera)蜜蜂科(Apidae)熊蜂族(Bombini)下的一個(gè)單系類群，全世界約250種，隸屬于15個(gè)亞屬[1]。作為野生植物和農(nóng)作物的重要傳粉昆蟲，熊蜂在維護(hù)生態(tài)系統(tǒng)平衡和提高農(nóng)業(yè)效益中發(fā)揮著十分重要的作用[2-3]。與其它傳粉昆蟲(包括家養(yǎng)的蜜蜂)相比，熊蜂具有傳粉效率高、耐陰暗潮濕環(huán)境、不易撞棚和飛逃等優(yōu)點(diǎn)，在設(shè)施農(nóng)業(yè)中具有明顯優(yōu)勢。目前，在歐洲各國、美國、日本等發(fā)達(dá)國家，熊蜂授粉技術(shù)已形成完整的產(chǎn)業(yè)鏈，取得很大的經(jīng)濟(jì)效益[3]。得益于熊蜂在生態(tài)和農(nóng)業(yè)方面的巨大價(jià)值，國外的科研人員對熊蜂的分類、生理、遺傳、行為和保護(hù)等學(xué)科領(lǐng)域，開展了大量的研究工作[4]。

中國是熊蜂資源最豐富的國家，約占全世界熊蜂資源的50%[5]。20世紀(jì)70年代以來，國內(nèi)外研究人員對中國熊蜂資源開展了相對系統(tǒng)的調(diào)查研究，取得了比較豐碩的成果。例如，An等[6]在前人的研究基礎(chǔ)上進(jìn)行梳理，確認(rèn)中國北方地區(qū)共有77種熊蜂：北京17種、天津5種、河北25種、山西28種、內(nèi)蒙古28種、陜西30種、甘肅56種和寧夏29種。Williams等[7]對中國川渝地區(qū)開展熊蜂調(diào)查和館藏整理發(fā)現(xiàn)，這一地區(qū)共有56種熊蜂。此外，研究人員對西藏(42種)、云南(27種)、吉林(12種)和浙江(10種)等地區(qū)的熊蜂資源也有不同程度的研究[8-11]。

青藏高原是全世界熊蜂生物多樣性最豐富的地區(qū)之一[6]。由于生態(tài)環(huán)境惡劣，這一地區(qū)傳粉昆蟲種類較少，尤其在高寒草地生態(tài)系統(tǒng)中，許多植物都嚴(yán)重依賴熊蜂授粉[12]。當(dāng)前，國內(nèi)外科研人員先后對西藏、四川、甘肅等省(區(qū))熊蜂物種多樣性進(jìn)行了調(diào)查[5-8,13]。然而，對于青藏高原的主體省份——青海省，目前沒有熊蜂方面的系統(tǒng)性研究。青海省東部地區(qū)，是青藏高原重要的農(nóng)牧交錯(cuò)地帶，地形復(fù)雜、氣候多變。為此，本研究針對這一地區(qū)的熊蜂資源開展調(diào)查，并進(jìn)行物種多樣性分析，以期為了解青藏高原的生物多樣性特征提供關(guān)鍵基礎(chǔ)資料。

1　材料與方法

1.1　研究區(qū)概況

研究區(qū)涵蓋青海省東部5個(gè)地級市：西寧市、海東市、海北州、海南州、黃南州，共轄23個(gè)縣市。本研究除了海東市下轄的3個(gè)縣(平安、循化、民和)未找到合適的采樣點(diǎn)外，其他縣(市)均完成一個(gè)種群的采樣(表1)。

1.2　標(biāo)本采集

2017年6-9月，在青海省東部地區(qū)進(jìn)行采樣調(diào)查，采集了樣點(diǎn)方圓1 km范圍內(nèi)的樣品。采樣工具為直徑40 cm的捕蟲網(wǎng)，將捕捉到的熊蜂置于扎孔的礦泉水瓶中，待其自然死亡，記錄詳細(xì)的采集地點(diǎn)(經(jīng)度、緯度和海拔)、采集時(shí)間和棲息地類型等信息。未死亡個(gè)體則帶回實(shí)驗(yàn)室，置于烘箱56 ℃條件下20 min左右，促其死亡。熊蜂死亡后，用昆蟲針固定在昆蟲盒里并逐一登記。

1.3　標(biāo)本鑒定

對所采集的標(biāo)本首先按照形態(tài)特征進(jìn)行歸類，依據(jù)為熊蜂胸部和腹部體節(jié)的毛的顏色及其配置、毛的長度和濃密程度，同時(shí)參考體型大小、喙的長度、單眼數(shù)量、胸部背面和腿脛節(jié)有無絨毛覆蓋等特征。將歸類的熊蜂與文獻(xiàn)中的圖譜資料[5-7,14]進(jìn)行比對，初步確定種類。對于分子鑒定，每個(gè)形態(tài)鑒定的種類隨機(jī)選取1～3頭，對其線粒體16S rDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測序，實(shí)驗(yàn)條件參考已發(fā)表的文獻(xiàn)[15]。測序結(jié)果用Chromas軟件批量輸出，并結(jié)合使用MEGA軟件[16]進(jìn)行比對和校對。將校對后的序列在GenBank中進(jìn)行在線BLAST，下載與本研究所測序列親緣關(guān)系最近的參考序列，在MEGA軟件中統(tǒng)計(jì)序列相似度。對于所測序列與參考序列完全相同的標(biāo)本，經(jīng)形態(tài)比對無明顯差異的，直接判定為參考序列對應(yīng)的物種。而與參考序列不完全相同的標(biāo)本，則根據(jù)文獻(xiàn)記錄[6-7]，下載形態(tài)上相似物種的16S rDNA序列進(jìn)行比對，統(tǒng)計(jì)差異位點(diǎn)數(shù)，利用排除法鑒別物種。

1.4　物種統(tǒng)計(jì)

圖1　有開發(fā)潛力的5種熊蜂工蜂標(biāo)本Fig. 1　Workers of five economical bumblebee species

1.5　統(tǒng)計(jì)分析

將鑒定后的數(shù)據(jù)輸入Excel表中，導(dǎo)入SPSS軟件，統(tǒng)計(jì)不同種群和不同物種的數(shù)量組成信息。利用R語言的vegan和spaa軟件包，計(jì)算各種群及總體的物種豐富度、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)。為了探討物種多樣性與環(huán)境因子之間的關(guān)系，用ArcGIS軟件提取了各采樣點(diǎn)年均溫(annual temperature,AT)、年降水(annual precipitation,AP)、年凈初級生產(chǎn)力(annual net primary production of the vegetation,ANPP)等信息。其中，年均溫和年降水的底圖來自于青藏高原科學(xué)數(shù)據(jù)中心(http:∥www.tpedatabase.cn)，為1961-1990年國內(nèi)各臺站數(shù)據(jù)經(jīng)插值計(jì)算得到。而年凈初級生產(chǎn)力底圖來自蒙大拿大學(xué)(ftp:∥ftp.ntsg.umt.edu)，為MODIS遙感數(shù)據(jù)2000-2015年的均值數(shù)據(jù)經(jīng)模型換算而來，計(jì)量單位為每年每平米固碳的克數(shù)。用SPSS軟件將3個(gè)多樣性指數(shù)與3個(gè)地理參數(shù)(經(jīng)度、緯度、海拔)和3個(gè)環(huán)境因子(年均溫、年降水、年凈初級生產(chǎn)力)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。需要指出的是，為了排除這些自變量之間可能存在的自相關(guān)，用多元線性回歸法的Backward策略進(jìn)行進(jìn)一步分析，確定與因變量相關(guān)性最大的自變量。

表1　熊蜂采樣點(diǎn)信息和樣本量Table 1　Geographical distribution and sample size of bumblebees

AT, annual temperature; AP, annual precipitation; ANPP, annual net prionary production of the vegetation; similarly for the following table 1.

2　結(jié)果與分析

2.1　物種多樣性及其分布

青海東部地區(qū)的20個(gè)縣市，共采集到3 195頭熊蜂(表2)。所有標(biāo)本進(jìn)行形態(tài)和分子鑒定，結(jié)果表明，青海省東部地區(qū)有熊蜂23種，涵蓋10個(gè)亞屬。由于每個(gè)物種的1～3條序列完全相同，每個(gè)物種僅選取1條序列進(jìn)行分析。經(jīng)比對和校對，得到23條線粒體16S rDNA序列，長度范圍525～536 bp。所測序列已提交到GenBank，SP01～SP23對應(yīng)GenBank號：MG681141～MG681163。由于黑尾熊蜂、火紅熊蜂、蘭州熊蜂和偽猛熊蜂的參考序列較短，因此僅對比對上的區(qū)段進(jìn)行分析(表2)。其中，20個(gè)物種的序列與參考序列完全相同，可以直接確定物種；而有3種與斯熊蜂、銹紅熊蜂和亞西伯熊蜂的參考序列分別有4、3和7個(gè)堿基(bp)的單核苷酸變異(SNP)或插入缺失(INDEL)，經(jīng)過與形態(tài)上相似物種進(jìn)行序列比較，用排除法完成鑒定。亞西伯熊蜂、紅束熊蜂和克什米爾熊蜂數(shù)量最多，分別占總數(shù)的12.4%、11.9%和10.6%，分布也較為廣泛，在絕大多數(shù)縣市(≥16)都有分布。越熊蜂、牛擬熊蜂和銹紅熊蜂則數(shù)量最少(表2、圖2)。

20個(gè)樣點(diǎn)中，物種數(shù)最多的是尖扎和樂都，分別采集到熊蜂20種和16種。物種數(shù)最少的是湟中和祁連，分別只有3個(gè)和4個(gè)物種(表3)。所有樣品的總體Shannon-Wiener多樣性指數(shù)為2.67，有4個(gè)樣點(diǎn)(樂都、貴德、尖扎、同仁)的Shannon-Wiener多樣性指數(shù)大于2.0，有2個(gè)(澤庫、湟中)則小于1.0。所有樣品的總體Pielou均勻度指數(shù)為0.85，有5個(gè)樣點(diǎn)(同仁、貴德、樂都、化隆、大通)的均勻度指數(shù)大于0.80，而有2個(gè)(貴南、澤庫)均勻度指數(shù)小于0.60。

2.2　物種多樣性的影響因素

Pearson相關(guān)分析顯示，物種豐富度與經(jīng)度顯著相關(guān)，Shannon-Wiener多樣性指數(shù)與年均溫顯著相關(guān)，Pielou均勻度指數(shù)與海拔顯著負(fù)相關(guān)，其余自變量和因變量之間無顯著關(guān)系(P>0.05)。西寧采樣點(diǎn)的3個(gè)多樣性指數(shù)值都異常偏離線性回歸曲線，將此采樣點(diǎn)數(shù)據(jù)去除后重新進(jìn)行Pearson相關(guān)分析；結(jié)果顯示，物種豐富度與經(jīng)度和氣溫同時(shí)顯著相關(guān)，Shannon-Wiener多樣性指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)都分別與海拔和氣溫同時(shí)顯著相關(guān)，而其余自變量和因變量之間無顯著關(guān)系(P>0.05)(表4)。

表2　熊蜂物種鑒定結(jié)果及數(shù)量分布Table 2　Species identification results and distributions of bumblebee

圖2　熊蜂各物種的頻率分布Fig. 2　Frequency of the bumblebee speciesty

縣(市)County樣本量Sample size物種豐富度S多樣性指數(shù)H'均勻度指數(shù)E經(jīng)濟(jì)物種比例Es/%大通Datong16071.580.818.13剛察Gangcha15271.280.6613.16共和Gonghe195101.650.7219.49貴德Guide205142.220.8417.56貴南Guinan18671.020.5316.13海晏Haiyan10691.400.6418.87河南Henan196121.780.714.59互助Huzhu167141.780.677.78化隆Hualong16091.790.829.38湟源Huangyuan159111.540.641.89湟中Huangzhong12630.740.670.00尖扎Jianzha187202.200.7317.11樂都Ledu157162.280.8234.39門源Menyuan13071.370.702.31祁連Qilian12941.050.760.00同德Tongde15461.370.7752.60同仁Tongren181132.190.8611.60西寧Xining16981.580.7667.46興海Xinghai162111.860.783.09澤庫Zeku11460.990.5557.89總數(shù)Total3 195232.670.8517.93

S，物種豐富度；H′，Shannon-Wiener多樣性；E，Pielou均勻度指數(shù)；Es, 經(jīng)濟(jì)物種比例。

S, species richness; H′, Shannon-Wiener diversity; E, Pielou evenness; Es, percentage of economic species; similarly for the following tables.

多元線性回歸顯示，包括西寧采樣點(diǎn)時(shí)(n=20)，

表4　熊蜂物種多樣性指數(shù)與環(huán)境因子的Pearson相關(guān)分析Table 4　Pearson correlation between bumblebee species diversity and environmental factors

*,P<0.05; **,P<0.01.

表5　青海東部地區(qū)熊蜂物種多樣性與環(huán)境因子的多元線性回歸分析的最適模型Table 5　Best fit models of multiple linear regression between bumblebee species diversity and environmental factors in eastern Qinghai

最優(yōu)模型中經(jīng)度、年均溫、海拔分別作為最優(yōu)自變量與物種豐富度、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、Pielou均勻度指數(shù)相關(guān)。而去除西寧采樣點(diǎn)后(n=19)，年均溫都作為最優(yōu)自變量與上述3個(gè)因變量顯著相關(guān)(表5、圖3)。

3　討論與結(jié)論

本研究結(jié)合形態(tài)特征和分子序列分析對熊蜂進(jìn)行了物種鑒定。分子序列分析的結(jié)果顯示，有20個(gè)物種的序列與GenBank中的參考序列完全一致，結(jié)合形態(tài)特征，可以鑒定到種。另外3個(gè)疑似物種(亞西伯熊蜂、銹紅熊蜂和斯熊蜂)與參考序列有少量差異。根據(jù)此前的文獻(xiàn)報(bào)道[6-7]，這3個(gè)物種的毛色及其配置方面具有比較明顯的鑒定特征：亞西伯熊蜂胸部前后都為黃色，中部及翅根周圍為完整的黑色條帶，腹部第3背板黑色，尾部紅色；銹紅熊蜂的胸部、翅根周圍、腹部背面都是橙色；斯熊蜂腹部第3背板黑色，而第5背板淺橙色。亞西伯熊蜂與昆侖熊蜂(B.keriensis)在毛色上相似度較高[6]，本研究所測序列與亞西伯熊蜂的參考序列有7 bp差異(5個(gè)SNP和2個(gè)INDEL)，然而與昆侖熊蜂參考序列(No. DQ788041)之間卻有48 bp差異(482/530)。銹紅熊蜂與牧場熊蜂(B.pascuorum)、斯氏熊蜂(B.schrencki)、角熊蜂(B.tricornis)以及黑足熊蜂(B.atripes)在棕紅色毛上有一定的相似性[6]，本研究所測序列與銹紅熊蜂的參考序列有3 bp(1個(gè)SNP和2個(gè)INDEL)差異，然而與牧場熊蜂(No. DQ788077)、斯氏熊蜂(No. AF364828)、角熊蜂(No. DQ788121)以及黑足熊蜂(No. DQ787971)的參考序列之間卻分別有27 bp(505/532)、14 bp(489/503)、57 bp(475/532)和54 bp(478/532)的差異。斯熊蜂尾部的淺橙色與部分密林熊蜂有一定的相似性[6]，本研究所測序列與斯熊蜂的參考序列有4 bp(全部為SNP)差異，然而與密林熊蜂的參考序列(No. DQ788041)之間卻有48 bp(488/536)的差異?？梢?，這些形態(tài)上比較相似的物種，在分子序列上出現(xiàn)混淆的可能性極低。因此，基于形態(tài)特征比較，同時(shí)參考分子序列信息，可對這3個(gè)物種進(jìn)行較為準(zhǔn)確的鑒定。

圖3　年均溫與熊蜂物種多樣性指數(shù)的線性回歸Fig. 3　Linear regression between annual temperature and bumblebee species diversity

A-C，包含西寧采樣點(diǎn)，即n=20；D-F，排除西寧采樣點(diǎn)，即n=19。

A-C, including Xining sampling site, i.e.n=20; D-F, excluding Xining sampling site, i.e.n=19.

從現(xiàn)有資料來看，盡管對于青海省的熊蜂資源未有專門研究[19]，然而零星調(diào)查或館藏記錄的物種有38種之多[6-7]。本研究顯示，青海東部地區(qū)有23種熊蜂，占青海省現(xiàn)有物種記錄的61%，未發(fā)現(xiàn)有該省的新記錄物種，這可能與本研究區(qū)域較小有關(guān)。從亞屬水平上看，與其他地區(qū)相比，青海東部地區(qū)的熊蜂(10個(gè)亞屬)具有很高的多樣性水平。例如，中國北方地區(qū)8個(gè)省級行政單元(北京、天津、河北、山西、內(nèi)蒙古、陜西、甘肅和寧夏)中，只有甘肅省達(dá)到10個(gè)亞屬[6]；同時(shí)，整個(gè)川渝地區(qū)也僅發(fā)現(xiàn)10個(gè)亞屬[7]。在物種多樣性方面，目前只有甘肅[5]和河北[20]的研究提供了多樣性數(shù)據(jù)。經(jīng)過計(jì)算，青海東部地區(qū)熊蜂的Shannon-Wiener多樣性(2.67)介于甘肅(3.03)和河北(2.39)兩省之間，而其Pielou均勻度指數(shù)(0.85)則高于甘肅(0.76)和河北(0.71)兩省?？梢?，本研究區(qū)域的熊蜂物種多樣性水平較高。

本研究發(fā)現(xiàn)，不同物種之間的數(shù)量及其分布特征差異很大，有3個(gè)物種(亞西伯熊蜂、紅束熊蜂和克什米爾熊蜂)的數(shù)量都各自占總數(shù)的10%以上，且在絕大多數(shù)采樣點(diǎn)都有分布，而有6個(gè)物種的數(shù)量占總體比例都低于1%，且僅在一兩個(gè)采樣點(diǎn)出現(xiàn)(表2)。此外，思?xì)M熊蜂和牛擬熊蜂屬于寄生型物種[7]，其數(shù)量非常有限。基于20個(gè)采樣點(diǎn)(n=20)的Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，青海東部地區(qū)熊蜂物種多樣性與環(huán)境因子之間有密切關(guān)聯(lián)。物種豐富度隨著經(jīng)度的增加(越靠近東部)而增加，Shannon-Wiener多樣性指數(shù)隨年均溫的升高而變大，Pielou均勻度指數(shù)則隨著海拔的升高而降低。多元線性回歸的結(jié)果與Pearson相關(guān)性分析結(jié)果基本一致。有趣的是，西寧采樣點(diǎn)的3個(gè)多樣性指數(shù)都異常偏離線性回歸曲線，而去除這個(gè)采樣點(diǎn)之后(n=19)，多樣性指數(shù)與環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)度明顯增強(qiáng)。去除西寧采樣點(diǎn)后多元線性回歸的結(jié)果顯示，3個(gè)多樣性指數(shù)都與年均溫關(guān)系最密切。此外，無論是否去除西寧采樣點(diǎn)的數(shù)據(jù)，其他3個(gè)環(huán)境因子(緯度、年降水、年凈初級生產(chǎn)力)都與物種多樣性關(guān)系不大。綜上，與大多數(shù)動(dòng)植物類群體現(xiàn)的規(guī)律一致[21]，氣溫是制約研究區(qū)域內(nèi)熊蜂物種多樣性的關(guān)鍵因子。另外，有研究表明，棲息地質(zhì)量對熊蜂的生存至關(guān)重要，人為活動(dòng)可能嚴(yán)重威脅熊蜂物種多樣性[22]。需要指出的是，西寧采樣點(diǎn)在西寧市南山，處于城市邊緣，而其他采樣點(diǎn)則全部位于偏僻的農(nóng)區(qū)或牧區(qū)。本研究認(rèn)為，人為活動(dòng)的干擾可能是導(dǎo)致西寧采樣點(diǎn)3個(gè)多樣性指標(biāo)都偏低的主要原因。

自1985年德國科學(xué)家Roseler發(fā)現(xiàn)CO2麻醉可以打破熊蜂滯育以來[23]，熊蜂的周年繁育技術(shù)取得突破性進(jìn)展。以荷蘭科伯特公司(KOPPERT)為代表的熊蜂授粉服務(wù)公司對地熊蜂(B.terrestris)的授粉技術(shù)研發(fā)獲得成功，并在全球推廣其商業(yè)品種。然而，由于技術(shù)封鎖和外來物種可能會(huì)導(dǎo)致生物入侵等問題[24-25]，各國都在開發(fā)本土的熊蜂物種。目前，美國、新西蘭、日本等發(fā)達(dá)國家都分別成功開發(fā)出適合本國的優(yōu)良熊蜂品種，并大規(guī)模推廣。中國的熊蜂研究起步較晚，在吳杰[2]等科研人員的努力下取得了一系列成就，對我國多種熊蜂成功進(jìn)行周年繁育和小規(guī)模授粉試驗(yàn)。本研究采集到的物種中，蘭州熊蜂、密林熊蜂、明亮熊蜂、火紅熊蜂已被證實(shí)具有市場開發(fā)潛力。其中，明亮熊蜂群勢較強(qiáng)，授粉性能良好；密林熊蜂群勢較大(可達(dá)300～400頭)，易于繁殖，但容易受螟蛾類侵?jǐn)_；火紅熊蜂具有采集植物種類多，年活動(dòng)時(shí)間長的優(yōu)點(diǎn)[18]。最新的研究表明，人工飼養(yǎng)條件下，蘭州熊蜂蜂王受精囊內(nèi)精子數(shù)量、工蜂數(shù)量僅次于地熊蜂，同時(shí)具有人工繁殖效率較高等優(yōu)點(diǎn)[26]。筆者所在課題組的養(yǎng)殖試驗(yàn)顯示，黑尾熊蜂野生蜂王啟動(dòng)繁殖個(gè)體的比例與火紅熊蜂相當(dāng)。同時(shí)，黑尾熊蜂還具有性格溫順、適應(yīng)性強(qiáng)、生態(tài)幅寬的優(yōu)點(diǎn)，也具有一定的市場開發(fā)潛力。本研究將上述5種熊蜂合并，作為可開發(fā)的經(jīng)濟(jì)物種，并統(tǒng)計(jì)其在各采樣點(diǎn)中的比例。結(jié)果顯示，總體上，經(jīng)濟(jì)物種占總數(shù)的17.9%，其中，西寧、澤庫、同德和樂都4個(gè)采樣點(diǎn)的經(jīng)濟(jì)物種占比超過30%。另外，將對這幾個(gè)地區(qū)的熊蜂進(jìn)行重點(diǎn)監(jiān)測，開展更為深入的生態(tài)學(xué)研究，為青藏高原地區(qū)熊蜂資源的開發(fā)、利用和保護(hù)提供關(guān)鍵基礎(chǔ)資料。