劉亞舉，龍　飛，李　瑾，岳俊濤，石美森

(1.河南省許昌市公安局 刑事科學(xué)技術(shù)研究所，河南 許昌 461000；2.貴州省遵義市公安局 刑偵支隊，貴州 遵義 563000； 3.中國政法大學(xué) 證據(jù)科學(xué)教育部重點實驗室， 北京 100192)

由于人類X染色體獨特的遺傳性質(zhì)，X染色體短串聯(lián)重復(fù)序列(X chromosome-short tandem repeat，X-STR)在法醫(yī)實踐中具有獨特的應(yīng)用價值[1]，在父母缺失的同父異母姐妹鑒定、祖母-孫女關(guān)系鑒定、父女關(guān)系鑒定、個體識別中性別的輔助檢驗和男性混合樣本的判讀等案件中往往能提供一定的證據(jù)信息。本研究采用MicroreaderTM19X ID System身份鑒定系統(tǒng)19X試劑盒，對中國漢族、仡佬族和苗族人群進(jìn)行19個X-STR基因座的遺傳多態(tài)性調(diào)查，評估其作為法醫(yī)學(xué)遺傳標(biāo)記的效能，積累相應(yīng)X-STR基因座群體遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，為法醫(yī)個體識別和親子鑒定提供資料。

1　材料與方法

1.1　樣本

根據(jù)知情同意原則，從健康體檢人群中隨機(jī)采集漢(308名，男女各154名)、仡佬(398名，男性296名、女性102名)和苗(323名，男性220名、女性103名)族無關(guān)個體外周血0.1 mL，滴入采血卡(武漢驥騰公司)，陰干后常溫保存。該研究得到相關(guān)道德倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2　方法

根據(jù)MicroreaderTM19X ID System熒光檢測試劑盒說明書，用直擴(kuò)法(免提取)對前述血樣進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在Mastercycler pro S銀座熱循環(huán)儀(Eppendorf公司)上進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，反應(yīng)體系為10 μL，內(nèi)含2.5×緩沖液C 4 μL、5×19X Primer Mix 2 μL、Taq PolymeraseⅡ 0.2 μL、純水3.8 μL和1.2 mm直徑血樣。熱循環(huán)參數(shù)為：96 ℃ 2 min；94 ℃ 5 s，60 ℃ 70 s，30個循環(huán)； 60 ℃ 30 min；15 ℃保溫。取1 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與0.5 μL內(nèi)標(biāo)Org500和8.5 μL去離子甲酰胺混合，95 ℃變性3 min后，冰浴3 min，置3500XL型遺傳分析儀(AB公司)上全自動毛細(xì)管電泳，Data Collection軟件收集數(shù)據(jù)，用GeneMarker? HID分析軟件(SoftGenetics公司)進(jìn)行等位基因分型，并采用GeneMapper ID-X v1.5分析軟件(AB公司)復(fù)核分析。每批樣本檢測均采用 9947A(AB公司)和超純水分別作為陽性對照和陰性對照。19個X-STR基因座的基本信息(表1)。

1.3　統(tǒng)計學(xué)分析

用PowerMarker? v3.25軟件分別統(tǒng)計3個民族的男性個體和女性個體在19個X-STR基因座的等位基因分布頻率。用Arlequin v3.5軟件對男性群體和女性群體之間各基因座的等位基因頻率分布差異進(jìn)行Fisher，s精確檢驗，并對19個X-STR基因座在3個民族群體中的基因型分布進(jìn)行Hardy-Weinberg平衡檢驗及各個基因座間的連鎖不平衡情況進(jìn)行檢驗。同時用PowerMarker? v3.25軟件和Cervus3.0軟件統(tǒng)計19個X-STR基因座在3個民族無關(guān)個體中的等位基因分布頻率,使用http://www.chrX-STR.org網(wǎng)站[2]在線計算功能，用男女合并后數(shù)據(jù)計算所得等位基因頻率，統(tǒng)計分析各個基因座在男性群體的個人識別率(DPM)，在女性群體的個人識別率(DPF)、雜合度(H)、三聯(lián)體平均非父排除率(MECtrio)、二聯(lián)體平均非父排除率(MECduo)和多態(tài)信息含量(PIC)等法醫(yī)學(xué)參數(shù)值[3- 4]。采用Arlequin v3.5軟件進(jìn)行19個X-STR基因座的等位基因分布與其他地區(qū)已有人群數(shù)據(jù)[5- 7]的差異比較。

表1　19個X-STR基因座的基本信息Table 1　General information of 19 markers included in the MicroreaderTM19X ID system

2　結(jié)果

2.1　19個X-STR基因座的檢測結(jié)果

經(jīng)陽性對照9947A反復(fù)測試，結(jié)果未見明顯變化。等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物(ladder)和3個民族1 029名無關(guān)個體均獲得清晰的電泳圖譜，分型結(jié)果明確(圖1)。男性個體每個基因座均只顯現(xiàn)一個等位基因峰，女性個體則有1個(純合子)或2個等位基因(雜合子)峰。

2.2　19個X-STR基因座的等位基因頻率分布

308名漢族(男女各154名)、398名仡佬族(男性296名，女性102名)和323名苗族(男性220名，女性103名)無關(guān)個體中分別檢出172、176和186種等位基因。經(jīng)Fisher’s精確檢驗，男性和女性群體等位基因的頻率分布差異無統(tǒng)計學(xué)差異，因此用男女合并后數(shù)據(jù)計算所得人群等位基因頻率分布(表2，F(xiàn)req1漢族、Freq2仡佬族、Freq3苗族)。等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物之外的稀有等位基因(off-ladder allele)被檢出(表2中粗體標(biāo)記的等位基因)。

2.3　群體遺傳學(xué)參數(shù)

19個X-STR基因座中，漢族除DXS10162外，仡佬族除DXS9907、DXS7423、DXS6810、GATA165B12及DXS10135外，苗族除DXS6795、DXS6800、DXS981及DXS10162外，基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡(P>0.05)，采用Bonferroni法修正，將P值設(shè)為0.0026(0.05/19)，發(fā)現(xiàn)19個X-STR基因座的基因型頻率分布在3個民族群體中均達(dá)到Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。19個X-STR基因座在3個民族人群的遺傳學(xué)參數(shù)(表3)。

2.4　19個X-STR基因座的基因連鎖不平衡分析

對19個X-STR基因座兩兩之間進(jìn)行連鎖不平衡檢驗，所有基因座兩兩之間均處于連鎖平衡狀態(tài)。

圖1　等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物和內(nèi)標(biāo)分型圖普Fig 1　Electropherogram of allelic ladders and internal size standard in the MicroreaderTM19X ID system

DXS6807DXS7423DXS9902alleleFreq1Freq2Freq3alleleFreq1Freq2Freq3alleleFreq1Freq2Freq3100.0025130.00490.01010.007770.00320.0050110.41720.45100.4907140.30680.30280.309680.00320.0031120.00810.00880.0077150.63470.63440.617590.02270.01880.0124130.02920.01380.0139160.04870.05150.0619100.44160.46110.4892140.32470.36930.3437170.00490.00130.0031110.31660.32290.3096150.18510.14200.1331120.20450.18340.1811160.03080.01260.0077130.00810.00750.0046170.00490.0031140.0013DXS6810DXS7133GATA165B12alleleFreq1Freq2Freq3alleleFreq1Freq2Freq3alleleFreq1Freq2Freq3140.003260.00490.00500.001570.0016150.00320.003870.004680.0025160.00970.00500.006280.00160.00750.006290.22560.27140.2895170.16070.16080.140990.74510.77760.7910100.55680.49120.4783180.48860.54020.5866100.19640.17590.1378110.18510.18340.1563190.32310.28390.2399110.05190.03270.0588120.03080.05150.0511200.01140.00630.0232120.0013130.0248210.0031

續(xù)表2

續(xù)表2

2.5　與其他地區(qū)人群X-STR基因座的頻率分布比較

對本研究的3個民族之間的頻率分布進(jìn)行比較分析，并分別與河南漢族(n=326)[5]、山東漢族(n=481)[6]、華東漢族(n=200)[7]群體比較，結(jié)果見表4[表中粗體標(biāo)記的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；-表示沒有數(shù)據(jù)]。

表3　19個X-STR基因座的群體遺傳學(xué)參數(shù)及Hardy-Weinberg平衡檢驗結(jié)果(P值)

續(xù)表3

表4　不同人群間X-STR基因座的等位基因頻率分布差異檢驗結(jié)果(exact P值)Table 4　Exact P values based on the comparison of allele frequencies in 6 national studies

續(xù)表3

3　討論

X-STR基因座核心重復(fù)單位有3和4核苷酸，本研究的19個X-STR基因座4核苷酸居多，有17個，占89.47%，因為擴(kuò)增產(chǎn)物中這類基因座比3核苷酸重復(fù)序列的影子帶少。另外，19個X-STR基因座的選擇也避開了4個連鎖群[8- 9]，連鎖度較低。

人類群體是一個具有多樣性特征的大群體，每一個種族的基因組經(jīng)過長期進(jìn)化過程而具有其自身所特有的征象，通過對各個種族的遺傳結(jié)構(gòu)特點及變化規(guī)律的研究，有助于在法醫(yī)DNA、人類進(jìn)化、種族起源和族群關(guān)系等方面的研究。中國有56個民族，研究中國不同民族群體的遺傳多態(tài)性，不僅對全面了解各民族群體的遺傳多態(tài)性和他們之間的相互關(guān)系有著非常重要的意義，同時也可以為探討人群的起源及遷徙路線提供重要的科學(xué)依據(jù)。因此，X-STR基因座在不同人群的多態(tài)性數(shù)據(jù)是法醫(yī)DNA應(yīng)用、群體遺傳學(xué)研究的基礎(chǔ)，不同地域、不同民族X-STR基因座的頻率分布存在差異，能夠為群體遺傳學(xué)和種群識別帶來一定的促進(jìn)作用[8- 9]。本次群體差異比較顯示，19個X-STR基因座在不同區(qū)域和不同種族之間具有差異，所以，在進(jìn)行法醫(yī)學(xué)證據(jù)價值評估時選擇對應(yīng)的群體是科學(xué)和必要的，這種結(jié)果也將為了解種族的起源與流轉(zhuǎn)及其語言學(xué)、考古學(xué)等學(xué)科提供重要的理論依據(jù)和參考資料。

多態(tài)性分析結(jié)果表明，19個X-STR基因座中，DXS7133和DXS6800具有中度多態(tài)性，其余17個基因座均具有高度多態(tài)性(PIC>0.5，H>0.5)，經(jīng)Bonferroni法修正，將p值設(shè)為0.0026(0.05/19)，發(fā)現(xiàn)19個X-STR基因座的基因型頻率分布在3個民族群體中均達(dá)到Hardy-Weinberg平衡，在漢、仡佬、苗族女性群體和男性群體中的累積個人識別率(CDP)分別為1～6.9199×10-18和1～5.4584×10-11、1～7.1551×10-18和1～6.1816×10-11、1～5.4507×10-18和1～4.8230×10-11，在漢、仡佬、苗族三聯(lián)體和二聯(lián)體中的累積平均非父排除率(MEC)分別為0.999 999 999 3696和0.999 999 5255、0.999 999 999 3699和0.999 999 5412、0.999 999 999 4723和0.999 999 5994。系統(tǒng)效能達(dá)到了法醫(yī)DNA檢驗的要求，是一組理想的X-STR遺傳標(biāo)記，能為疑難親緣鑒定案件的鑒定提供有效的手段，在法醫(yī)學(xué)鑒定中有較高的應(yīng)用價值。

綜上所述，本研究獲得了中國漢、仡佬和苗族群體19個X-STR基因座的等位基因頻率分布數(shù)據(jù)，為建立這3個民族群體X-STR分布數(shù)據(jù)庫、法醫(yī)學(xué)應(yīng)用及遺傳關(guān)系的分析提供了良好的遺傳背景數(shù)據(jù)。