石文慧，安 然，郭海霞，張金文，，王朋寶，曹 智，王志偉，喬 巖

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅蘭州 730070； 2.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)試驗(yàn)室，甘肅蘭州 730070；3.甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)試驗(yàn)室，甘肅蘭州 730070)

甘藍(lán)型油菜(BrassicanapusL.)是重要的油料作物，30多年來(lái)油菜轉(zhuǎn)基因研究得到了迅速發(fā)展，以轉(zhuǎn)基因技術(shù)為核心的生物技術(shù)被譽(yù)為第二次“綠色革命”。陳錦清等育成的高含油量轉(zhuǎn)基因油菜超油1號(hào)、超油2號(hào)新品系是目前世界上含油量最高的甘藍(lán)型油菜[1]。何業(yè)華等將Bt基因?qū)敫仕{(lán)型油菜湘油13號(hào)，現(xiàn)已獲得遺傳穩(wěn)定的抗蟲(chóng)油菜新品系[2]。但轉(zhuǎn)化過(guò)程中，植物組織與攜帶目的基因的根癌農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，往往難以抑制和脫除農(nóng)桿菌，使得外植體成活率下降，愈傷誘導(dǎo)率和芽再生率降低，轉(zhuǎn)化效率偏低，從而限制轉(zhuǎn)基因技術(shù)的廣泛利用，影響油菜育種水平的提高和新基因的功能分析鑒定。因此，為實(shí)現(xiàn)高效的遺傳轉(zhuǎn)化，有必要找到一種高效抗生素，在有效脫除農(nóng)桿菌的同時(shí)，減少對(duì)愈傷誘導(dǎo)和芽再生的抑制作用，對(duì)于甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)法已成為油菜等蕓薹屬植物基因轉(zhuǎn)化中最常用的方法。目前為止，已先后在甘藍(lán)型油菜、白菜型油菜、芥菜等作物上實(shí)現(xiàn)了報(bào)告基因、抗除草劑基因、抗病蟲(chóng)基因、雄性不育基因、改良油菜成分和蛋白組分基因等的遺傳轉(zhuǎn)化。2004年山西農(nóng)業(yè)大學(xué)利用花粉介導(dǎo)法將GUS基因轉(zhuǎn)入油菜，其轉(zhuǎn)化頻率高達(dá)2.8%，逐步建立甘藍(lán)型冬油菜花粉介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的新體系[3]。盧愛(ài)蘭等將蕪菁花葉病毒基因?qū)胗筒?，獲得對(duì)油菜黃化花葉病毒(TuMV)抗性[4]。2014年徐茜育成了具有抗草甘膦基因的甘藍(lán)型油菜新品種浙大619[5]。石東喬等將反義油酸脫飽和酶基因(Fad2基因)導(dǎo)入油菜，獲得了高油酸含量，低亞油酸、亞麻酸的轉(zhuǎn)基因油菜[6]。長(zhǎng)期以來(lái)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化采用的抑菌劑多為羧芐青霉素和頭孢霉素，因?yàn)樗鼈兛梢砸种圃松锛?xì)胞壁的生成，進(jìn)而抑制細(xì)菌。關(guān)于羧芐青霉素(carbenecillin)和頭孢霉素(cefotaxime)對(duì)油菜轉(zhuǎn)化的研究已有報(bào)道[7]，裴冬麗等在白菜型油菜的轉(zhuǎn)化中發(fā)現(xiàn)這2種抗生素對(duì)農(nóng)桿菌菌株LBA4404有很強(qiáng)的抑制作用[8]。高武軍等研究發(fā)現(xiàn)500 mg/L的羧芐青霉素可以完全抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)[9]。Han等在小麥的遺傳轉(zhuǎn)化中發(fā)現(xiàn)頭孢霉素在250 mg/L可以完全抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)[10]。在高梁遺傳轉(zhuǎn)化中發(fā)現(xiàn)250～500 mg/L的羧芐青霉素可以有效抑制農(nóng)桿菌[11]。但是，以上研究并沒(méi)有分析頭孢霉素和羧芐青霉素對(duì)植物再生潛力的影響。有研究認(rèn)為頭孢霉素可能會(huì)抑制芽的分化[12-14]，而羧芐青霉素則抑制根的形成[15]。此外，抗生素的濃度對(duì)遺傳轉(zhuǎn)化也有一定的影響。如濃度為250 mg/L的頭孢霉素不利于玉米愈傷組織的形成[16]，并最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率反而低于100 mg/L的處理；羧芐青霉素在隨后的試驗(yàn)中都采用100 mg/L來(lái)抑制農(nóng)桿菌[17]。特美汀(timentin)和阿莫西林(amoxicillin)是應(yīng)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化中的新型抗菌素，特別是在胚性愈傷組織再生系統(tǒng)中具有很好地抑菌效果，而且對(duì)組織再生的抑制較小。Costa等在農(nóng)桿菌介導(dǎo)煙草的轉(zhuǎn)化中發(fā)現(xiàn)特美汀具有較高的轉(zhuǎn)化頻率并對(duì)根的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用[18]。胡威研究柑橘時(shí)發(fā)現(xiàn)特美汀降低了芽的再生頻率，導(dǎo)致70%的再生芽產(chǎn)生突變，而在阿莫西林的培養(yǎng)基中是正常的[19]。阿莫西林是一種無(wú)菌單獨(dú)包裝、穩(wěn)定且便于攜帶的抗生素，其價(jià)格相對(duì)于羧芐青霉素、頭孢霉素、特美汀便宜。2014年Naing等首次研究了阿莫西林對(duì)“鮮紅”菊花[Chrysanthemummorifolium(Ramat)]葉片外植體培養(yǎng)的植株再生能力的影響，發(fā)現(xiàn)250 mg/L的阿莫西林不但可以抑制農(nóng)桿菌菌株LBA4404，而且對(duì)外植體具有高效的轉(zhuǎn)化頻率，證明了阿莫西林可有效取代羧芐青霉素或頭孢霉素[20]。但阿莫西林應(yīng)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化中并未見(jiàn)報(bào)道。

因此，本研究在油菜種質(zhì)遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，設(shè)置4種不同濃度的抗生素，以確定適合于甘藍(lán)型油菜農(nóng)桿菌介導(dǎo)的抗生素種類(lèi)和濃度，并明確阿莫西林在甘藍(lán)型油菜遺傳轉(zhuǎn)化中的效果，這對(duì)于提高農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜遺傳轉(zhuǎn)化效率、加快油菜種質(zhì)資源創(chuàng)新具有重要的理論價(jià)值和應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與藥品

以甘藍(lán)型油菜雜交種青雜5號(hào)的恢復(fù)系“1831R”為試驗(yàn)材料。農(nóng)桿菌菌株選用LBA4404、GV3101。植物表達(dá)載體為pCAMBIA1300(圖1)，該載體使用草甘膦抗性基因EPSPS(5-enolpyruvy lshikmate-3-phosphate synthase，5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶)替換了pcAMBIA1300的潮霉素抗性標(biāo)記Hyp(圖1)。羧芐青霉素(Carb)、頭孢霉素(Cef)、特美汀(Tim)、阿莫西林(Amo)、Kan、Rif、AgNO3、AS、6-BA、2，4-D、NAA、草甘膦均用0.22 μm的濾膜抽濾。

1.2 方法

1.2.1 外植體的制備 外植體制備參照鄒智等的研究方法[21]。選取籽粒飽滿的種子，70%乙醇浸泡30 s，無(wú)菌水沖洗2～3次；1%的次氯酸鈉溶液(0.3 g+30 mL H2O2)浸泡 13～15 min(期間不時(shí)搖動(dòng))，無(wú)菌水沖洗3～5次；接種于萌發(fā)培養(yǎng)基上，每瓶約20粒種子，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)誘導(dǎo)萌發(fā)，培養(yǎng)條件如下：溫度(25±3)℃下，光照16 h/d，光強(qiáng)2 000 lx萌發(fā)。4～5 d后切取其下胚軸，轉(zhuǎn)接于預(yù)培培養(yǎng)基。

1.2.2 含表達(dá)載體pCAMBIA1300的農(nóng)桿菌菌株LBA4404、 GV3101的活化 參照王關(guān)林等所述的方法[22]。(1)取出含表達(dá)載體pCAMBIA1300的農(nóng)桿菌菌株LBA4404劃線接種于含50 mg/L Kan+50 mg/L Rif的YEP固體培養(yǎng)基平板上，28 ℃ 下倒置黑暗培養(yǎng)2～3 d。(2)于轉(zhuǎn)化前1 d挑取單菌落，接種于20 mL含50 mg/L Kan+50 mg/L Rif的YEP液體培養(yǎng)基中，置于搖床上28 ℃下200～210 r/min培養(yǎng)過(guò)夜(16 h 左右)，使菌體達(dá)到對(duì)數(shù)期(D600 nm=0.6～0.8)。(3)取400 μL菌液轉(zhuǎn)接入20 mL無(wú)抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)4～6 h。(4)將菌液倒入無(wú)菌帶蓋的50 mL離心管內(nèi)，蓋上管蓋，用封口膜封口，4 000 r/min離心5 min。(5)取出離心管，在超凈工作臺(tái)上棄去上清，向離心管內(nèi)加入適量MS液體培養(yǎng)基，懸浮起菌體，28 ℃下210 r/min離心，使其吸光度達(dá)到0.4～0.6 之間，即可用作接種外植體的工程菌液。農(nóng)桿菌GV3101的活化等同。

1.2.3 外植體的農(nóng)桿菌侵染 將預(yù)培2～3 d的下胚軸置于無(wú)菌的小培養(yǎng)皿中，向皿中倒入制備好的工程菌液，中間輕緩晃動(dòng)數(shù)次，3～5 min后倒掉菌液，然后將下胚軸投入無(wú)菌水中清洗3遍，置于無(wú)菌濾紙上，吸干表面液滴，隨即轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(不含抗生素和草甘膦)中，25 ℃下黑暗培養(yǎng)2 d。

1.2.4 4種抗生素對(duì)抑制2種土壤根癌農(nóng)桿菌菌株的作用 試驗(yàn)設(shè)計(jì)2個(gè)處理，即將500 mg/L 4種抗生素(Carb、Cef、Tim、Amo)分別加入2種土壤根癌農(nóng)桿菌菌株的YEP培養(yǎng)基(分別挑取農(nóng)桿菌菌株LBA4404、GV3101的單菌落于25 mL含50 mg/L Kan+50 mg/L Rif的YEP液體培養(yǎng)基中)，置于搖床上28 ℃下200～210 r/min培養(yǎng)過(guò)夜(16 h左右)，2種土壤根癌農(nóng)桿菌菌株的YEP培養(yǎng)基不加任何抗生素設(shè)為對(duì)照，然后分別測(cè)其吸光度。

1.2.5 抗生素濃度設(shè)計(jì)和抑菌效果鑒定 試驗(yàn)設(shè)計(jì)4個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)6個(gè)濃度梯度，即100、200、300、400、500、600 mg/L，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。將農(nóng)桿菌菌株LBA4404侵染后共培養(yǎng)2 d的外植體轉(zhuǎn)入抑菌培養(yǎng)基。培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)分別添加不同濃度的抗生素，于植物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為28 ℃、16 h/8 h光周期、光照度 2 000 lx。在培養(yǎng)3 d后連續(xù)觀察抑菌情況。抑菌完全的標(biāo)準(zhǔn)為外植體在與培養(yǎng)基接觸的部位未出現(xiàn)農(nóng)桿菌菌落。抑菌率=未孳生農(nóng)桿菌的外植體數(shù)/農(nóng)桿菌侵染后的總外植體數(shù)×100%。

1.2.6 抗生素對(duì)芽再生的影響鑒定 在抑菌7 d之后，采用楊長(zhǎng)友等報(bào)道的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，含4.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA+3.5 mg/L AgNO3，NAA、AgNO3、滅菌后另加)[23]，培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，按“1.2.5”節(jié)設(shè)計(jì)的抗生素濃度梯度，分別添加，同時(shí)設(shè)置對(duì)照試驗(yàn)，即外植體(未經(jīng)農(nóng)桿菌侵染)在愈傷誘導(dǎo)過(guò)程中不加抗生素，28 ℃、16 h/8 h 光周期、光照度2 000 lx培養(yǎng)20 d后連續(xù)觀察愈傷誘導(dǎo)情況。采用王俊生等報(bào)道的愈傷分化培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基，含2.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA，NAA滅菌后另加)[24]。培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，按“1.2.5”節(jié)設(shè)計(jì)的抗生素濃度梯度，分別添加，同時(shí)設(shè)置對(duì)照試驗(yàn)，即外植體(未經(jīng)農(nóng)桿菌侵染)愈傷分化過(guò)程中不加抗生素，培養(yǎng)條件為28 ℃、16 h/8 h光周期、光照度2 000 lx，培養(yǎng)15 d后觀察芽再生情況。芽再生率=帶芽外植體數(shù)/總外植體數(shù)×100%

1.2.7 草甘膦抗性篩選及PCR檢測(cè) 試驗(yàn)設(shè)計(jì)4個(gè)處理，即依據(jù)“1.2.6”節(jié)試驗(yàn)結(jié)果分別在芽再生培養(yǎng)基加入4種抗生素各自相對(duì)應(yīng)的最適濃度，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。同時(shí)加入抗性篩選試劑草甘膦(Gly)，濃度為8 mg/L。芽再生培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，含4.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+8 mg/L Gly，NAA、抗生素滅菌后另加。15 d后統(tǒng)計(jì)擬轉(zhuǎn)基因植株，并進(jìn)行PCR驗(yàn)證，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)化率=轉(zhuǎn)基因植株總數(shù)/總外植體數(shù)×100%。

用CTAB法提取擬轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照(未轉(zhuǎn)化植株)的基因組DNA，用于PCR擴(kuò)增。

EPSPS基因的PCR引物為5′-TCTACAAATCTATCTC-TCTCG-3′、5′-GGAACTACTCACACATTATTA-3′。

產(chǎn)物長(zhǎng)度為1 350 bp，建立25 μL反應(yīng)體系：ddH2O(17.5 μL)、10×PCR Buffer(2.5 μL)、dNTP Mixture(2.0 μL)、上游引物(0.75 μL)、下游引物(0.75 μL)、TaKaRaTaq(0.5 μL)。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，52.9 ℃ 30 s，72 ℃ 81 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。反應(yīng)結(jié)束后，用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003和SPSS 19.0進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 4種抗生素對(duì)抑制根癌農(nóng)桿菌的效果

500 mg/L的4種抗生素對(duì)抑制根癌農(nóng)桿菌菌株(LBA4404、GV3101)的效果如圖2所示。結(jié)果顯示，加入羧芐青霉素(Carb)、頭孢霉素(Cef)、特美汀(Tim)、阿莫西林(Amo)的液體YEP培養(yǎng)基吸光度都為0。在對(duì)照試驗(yàn)中，吸光度在正常值(0.6～0.8)之間。說(shuō)明濃度為500 mg/L的4種抗生素均有抑制農(nóng)桿菌菌株LBA4404、GV3101繁殖和生長(zhǎng)的效果，可以用于后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 4種不同濃度抗生素在MS固體培養(yǎng)基上的抑菌效果

如圖3所示，4種抗生素濃度在500～600 mg/L對(duì)抑菌率的影響差異不顯著，而在100～400 mg/L對(duì)抑菌率的影響差異顯著。其中，100 mg/L時(shí)，Carb比Cef、Tim、Amo抑菌率高151.11%、303.57%、32.94%，Amo比Cef、Tim抑菌率高88.89%、203.57%；200 mg/L時(shí)，Carb比Cef、Tim抑菌率高37.65%、105.26%，Amo比Cef、Tim抑菌率高88.89%、203.57%；300 mg/L時(shí)，Carb比Tim抑菌率高50.63%，Amo比Tim抑菌率高49.37%；400 mg/L時(shí)，Carb比Tim抑菌率高10.78%，Amo比Tim抑菌率高8.01%。表明較高濃度(500～600 mg/L)抗生素處理下，4種抗生素都可以很好地抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)。同時(shí)，濃度低于500 mg/L時(shí)，Carb抑菌效果最好，其次是Amo，再次是Cef、Tim。

以Amo為例，共培養(yǎng)7 d后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濃度在400～600 mg/L 時(shí)，其抑菌效果如圖4-a、圖4-b、圖4-c所示，接種下胚軸的培養(yǎng)基中未見(jiàn)農(nóng)桿菌孳生；當(dāng)濃度為300 mg/L時(shí)，培養(yǎng)基中雖未見(jiàn)農(nóng)桿菌孳生，但下胚軸少許脫水且與培養(yǎng)基接觸的部位呈水漬狀，褐化較嚴(yán)重，活性降低，如圖4-d；當(dāng)濃度為100～200 mg/L時(shí)，下胚軸基部出現(xiàn)大量農(nóng)桿菌菌落，菌落數(shù)與抗生素濃度呈反比。

2.3 4種不同濃度的抗生素對(duì)芽生長(zhǎng)的影響

4種不同濃度的抗生素對(duì)芽生長(zhǎng)的影響不同(圖5)。從總體趨勢(shì)來(lái)看，隨著4種抗生素濃度的增加，芽再生率呈先增加后降低趨勢(shì)，其中濃度在300 mg/L時(shí)達(dá)到最大；且在相同濃度下，經(jīng)Amo處理的芽再生率最高，其次為Carb、Tim、Cef。當(dāng)Amo濃度在100～200 mg/L時(shí)，比相同濃度下的Carb、Cef、Tim芽再生率高3.62%、13.86%、14.05%；當(dāng)Amo濃度在300 mg/L時(shí)，比相同濃度下的Carb、Cef、Tim芽再生率高 1.86%、9.76%、9.76%；當(dāng)Amo濃度在400～600 mg/L時(shí)，比相同濃度下的Carb、Cef、Tim芽再生率高1.29%、9.53%、8.98%。由以上結(jié)果可知，4種抗生素中阿莫西林濃度在300 mg/L 時(shí)最適于芽再生。

以Amo為例，其不同濃度對(duì)愈傷誘導(dǎo)芽再生的影響不同，Amo濃度在300～600 mg/L下時(shí)，可以發(fā)現(xiàn)隨著濃度的增加，經(jīng)愈傷誘導(dǎo)芽再生的數(shù)量在明顯下降，當(dāng)濃度增加至600 mg/L時(shí)，愈傷組織停止生長(zhǎng)而且生長(zhǎng)出毛根，這表明高濃度的抗生素可抑制愈傷組織芽的再生。圖6中e～h是第35天時(shí)4種抗生素濃度在300 mg/L時(shí)對(duì)愈傷誘導(dǎo)芽再生的生長(zhǎng)狀況。經(jīng)Amo處理的芽的生長(zhǎng)要優(yōu)于Cef、Tim，而與Carb處理的芽的生長(zhǎng)狀況差異不大；經(jīng)Cef處理的愈傷組織分化的再生芽呈現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象；經(jīng)Tim處理的愈傷組織出現(xiàn)綠點(diǎn)，但并未分化出芽。

2.4 草甘膦抗性篩選及PCR檢測(cè)

500個(gè)總外植體，經(jīng)草甘膦抗性篩選，轉(zhuǎn)化過(guò)程使用Carb的擬轉(zhuǎn)化植株18株；使用Cef的擬轉(zhuǎn)化植株13株；使用Tim的擬轉(zhuǎn)化植株8株；使用Amo的擬轉(zhuǎn)化植株25株。提取擬轉(zhuǎn)化植株的DNA，以質(zhì)粒pCAMBIA1300為陽(yáng)性對(duì)照，以未轉(zhuǎn)化植株為陰性對(duì)照，進(jìn)行PCR擴(kuò)增(圖7)，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化效率(圖8)。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)使用Carb的擬轉(zhuǎn)化植株18株中經(jīng)PCR擴(kuò)增得到6株與預(yù)期長(zhǎng)度一樣的擴(kuò)增產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化效率為1.2%；使用Cef的擬轉(zhuǎn)化植株13株中經(jīng)PCR擴(kuò)增得到3株與預(yù)期長(zhǎng)度一樣的擴(kuò)增產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化效率為1.0%；使用Tim的擬轉(zhuǎn)化植株8株中經(jīng)PCR擴(kuò)增未得到與預(yù)期長(zhǎng)度一樣的擴(kuò)增產(chǎn)物；使用Amo的擬轉(zhuǎn)化植株25株經(jīng)PCR擴(kuò)增得到10株與預(yù)期長(zhǎng)度一樣的擴(kuò)增產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化效率為1.9%。Amo比Carb、Cef轉(zhuǎn)化效率分別高58.33%、90.00%。而陰性對(duì)照未擴(kuò)增到相應(yīng)的片段。初步證明EPSPS基因已成功導(dǎo)入到甘藍(lán)型油菜恢復(fù)系中，且說(shuō)明轉(zhuǎn)化過(guò)程適用Amo的轉(zhuǎn)化效率是最高的。

3 討論與結(jié)論

本研究表明，在甘藍(lán)型油菜雜交種青雜5號(hào)的恢復(fù)系“1831R”的遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，采用新型的抗生素制劑，包括了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化中常用的抗生素[羧芐青霉素(Carb)、頭孢霉素(Cef)]和尚未廣泛應(yīng)用的新型抗生素[阿莫西林(Amo)、特美汀(Tim)]，以轉(zhuǎn)化再生植株表現(xiàn)為依據(jù)，研究4種抗生素對(duì)農(nóng)桿菌的脫除效果以及對(duì)油菜再生植株轉(zhuǎn)化率的影響，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化初期，較高濃度(500～600 mg/L)抗生素處理下，4種抗生素都可以很好地抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，濃度低于500 mg/L時(shí)，Carb抑菌效果最好，其次是Amo，再次是Cef、Tim。周小梅等在研究9種抗生素的抑制效果時(shí)發(fā)現(xiàn)Carb在500 mg/L、Cef在600 mg/L時(shí)對(duì)農(nóng)桿菌菌株LBA4404、EHA105可以達(dá)到很好的抑菌效果[7]，本研究結(jié)果與之類(lèi)似。Gould等在松樹(shù)遺傳轉(zhuǎn)化中也得到類(lèi)似的研究結(jié)果[25]。Naing等在菊花的研究中發(fā)現(xiàn)，Amo在250 mg/L可以完全抑制農(nóng)桿菌菌株LBA4404的生長(zhǎng)[20]。黃昌蓉在研究甘藍(lán)型油菜早熟基因遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立時(shí)發(fā)現(xiàn)，分化培養(yǎng)階段500 mg/L的Tim難以控制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，會(huì)導(dǎo)致外植體全部褐化，然后死亡[26]，但本研究發(fā)現(xiàn)，Tim在400 mg/L時(shí)可以達(dá)到很好的抑菌效果，這可能與農(nóng)桿菌侵染的菌液濃度和時(shí)間有關(guān)，而本研究與Cheng等研究煙草遺傳轉(zhuǎn)化中的結(jié)果[27]類(lèi)似。

抗生素不僅對(duì)農(nóng)桿菌有抑制作用，而且對(duì)芽再生也有一定的影響。適宜的抑菌劑既要對(duì)農(nóng)桿菌具有良好的抑制作用，又不能對(duì)外植體生長(zhǎng)產(chǎn)生較大影響[28]。在芽再生階段，隨著4種抗生素濃度的增加，芽再生率呈先增加后降低趨勢(shì)，其中濃度在300 mg/L時(shí)達(dá)到最大。且在相同濃度下，經(jīng)Amo處理的芽再生率最高，其次為Carb、Tim、Cef。Naing研究發(fā)現(xiàn)Carb和Amo對(duì)芽再生的影響比Cef小，本試驗(yàn)結(jié)果與之一致。Ren在研究柑橘的遺傳轉(zhuǎn)化中發(fā)現(xiàn)經(jīng)阿莫西林處理的愈傷組織誘導(dǎo)芽再生的頻率優(yōu)于特美汀處理[19]，本研究結(jié)果與之一致。Cef和Tim在不同濃度下誘導(dǎo)愈傷組織產(chǎn)生再生芽數(shù)量低于Carb，這與前人在疫苗、結(jié)球甘藍(lán)、玉米中的研究結(jié)果[15-19]類(lèi)似。經(jīng)草甘膦抗性篩選及PCR檢測(cè)，轉(zhuǎn)化體系中使用Amo的轉(zhuǎn)化效率比Carb、Cef轉(zhuǎn)化效率分別高58.33%、90.00%。

綜上，阿莫西林是甘藍(lán)型油菜雜交種青雜5號(hào)的恢復(fù)系“1831R”遺傳轉(zhuǎn)化中最適的抗生素。羧芐青霉素、頭孢霉素、阿莫西林、特美汀對(duì)后續(xù)再生芽生根能力是否有影響，以及殘留的抗生素是否會(huì)影響轉(zhuǎn)化植株移栽至大田后的生長(zhǎng)，有待進(jìn)一步研究。